文化大革命期间，因林彪、江青反革命集团破坏而被严重扩大化的一次批判和打击极左分子的运动。

所谓“五一六”，原指1967年6月14日，北京外语学院的刘令凯与钢铁学院的张建期串连，在外语学院成立的“首都红卫兵五一六兵团”。他们认为《五一六通知》的通过，导致了刘少奇、邓小平的被打倒。这一通知在1967年通过一周年时公开发表，也将有大人物被揪出，这个人物就是周恩来，所以便打起《五一六通知》作为自己的旗帜。但由于此前他们公开进行的反对周恩来的活动曾受到群众的揭露和批判，于是便采取隐蔽的方式，经常在夜深人静之时张贴标语、大字报和传单。当时，在北京动物园门口、甘家口市场、西四丁字街等处都曾有过他们行动的足迹。如张贴《周总理要干什么?》，《周总理是二月逆流的总后台》，《周恩来之流的要害是背叛〈五一六通知〉》等大字报和大标语。这些人的行动激起了广大群众的愤恨。为了抵制“怀疑一切，打倒一切”的极左思潮，打击以“左”的面目出现的反革命活动，毛泽东决定开展批判和打击“五一六”反革命集团的活动。

在1967年9月8日，《人民日报》发表姚文元文章《评陶铸的两本书》时，毛泽东在文章结尾加了一段话：“请同志们注意：现在有一小撮反革命分子也采用了这个办法，他们用貌似极左而实质极右的口号，刮起‘怀疑一切’的妖风，炮打无产阶级司令部，挑拨离间，混水摸鱼，妄想动摇和分裂以毛主席为首的无产阶级司令部，达到其不可告人的罪恶目的，所谓‘五一六’的组织者和操纵者，就是这样一个搞阴谋的反革命集团。应予彻底揭露。”同时又指出：“这个反革命组织的目的是两个，一个是要破坏和分裂以我们伟大领袖毛主席为首的党中央的领导;一个是要分裂和破坏无产阶级专政的主要支柱——伟大的人民解放军。”此后不久，这个自称“首都红卫兵五一六兵团”的小组织，很快就被揭露了，其主要成员也被拘捕审查。在其他地区并未发现类似的组织。

但1968年中央决定成立清查“五一六”专案领导小组，陈伯达任组长，谢富治、吴法宪为小组成员。此后，在全国范围内开展了批判和清查“五一六”的运动。当时，虽然在少数单位清查出一些“五一六”反革命分子，但在全国范围内揪“五一六”分子是缺乏根据的。由于对所谓“五一六”并没有明确的标准和标志，林彪、江青等人为了掩盖自己煽动极左思潮和打倒一切的阴谋，故意把水搅浑，他们抓住毛泽东提出的“五一六”的两个目的，提出凡是把矛头指向无产阶级司令部、指向人民解放军、指向革命委员会之一者，即为“五一六”分子。结果给清查的领导者以很大的随意性，有的打击对立面或某些造反派头头，也有的大搞逼供信，随意乱咬人，从而株连了大批无关、无辜的群众。

1970年3月27日，中共中央发出《关于清查“五一六”反革命阴谋集团的通知》。要求各地继续贯彻抓紧开展清查“五一六”的运动。《通知》一方面要求防止扩大化的倾向，但同时又强调，认为根本不存在“五一六”是“完全错误”的。通知说：国内外阶级敌人同我们的斗争是很复杂的，反革命秘密组织决不是只有“五一六”，鼓动人们去抓更多的“反革命”。

1971年2月，经毛泽东批准，还成立了“联合专案组”，用以统筹全国清查“五一六”的步伐。这样就更助长了扩大化的倾向，以致演变成为全国性的两派群众组织间的互抓“五一六”的大混战。许多人蒙冤，惨遭迫害。

后来，清查“五一六”又作为“清理阶级队伍”的一个重要内容，延续了很长时间，许多单位直到“文化大革命”结束才停止下来。事实表明，这场清查运动犯了严重的扩大化错误，并且颇具戏剧性。先是把受错误打击的杨成武、余立金、傅崇碧、肖华等人民解放军的高级将领同被审查的中央文革成员王力、关锋、戚本禹等被并列为“五一六”的黑后台。中共九届二中全会之后，专案组长陈伯达也成了黑后台。“九一三”事件后，林彪又成了最大的黑后台。最后，清查“五一六”的办公室主任、公安部长李震自杀身亡，这场运动只好不了了之。

粉碎“四人帮”之后，蒙冤受害的群众得到了平反。