本程序和检验方法规定了评价食品保健作用的统一程序和检验方法。
本程序和检验方法适用于评价食品的免疫调节、延缓衰老、改善记忆、促进生长发育、抗疲劳、减肥、耐缺氧、抗辐射、抗突变、抑制肿瘤、调节血脂、改善性功能等作用。
本程序和检验方法规定了评价食品保健作用的人体试食试验规程。
2 进行食品保健作用评价的基本要求
2.1 对受试物的要求
2.1.1 提供受试物的物理、化学性质 (包括化学结构、纯度、稳定性等) 等有关资料。
2.1.2 受试物必须是规格化的产品,即符合既定的生产工艺、配方及质量标准。
2.1.3 提供受试物安全性毒理学评价的资料,受试物必须是已经过食品安全性毒理学评价确认为安全的物质。
2.2 对实验动物的要求
2.2.1 根据各种试验的具体要求,合理选择实验动物。常用大鼠和小鼠,品系不限,推荐使用近交系动物。
2.2.2 动物的性别不限,可根据试验需要进行选择。动物的数量要求为小鼠每组至少10只 (单一性别),大鼠每组至少8只 (单一性别)。动物的年龄可根据具体试验需要而定。
2.2.3 动物应达到二级实验动物的要求。
2.3 给受试物的剂量及时间
2.3.1 各种试验至少应设3个剂量组,1个对照组,必要时可设阳性对照组。剂量选择应合理,尽可能找出最低有效剂量。在3个剂量组中,其中一个剂量应相当于人推荐摄入量的5～10倍左右。
2.3.2 给受试物的时间应根据具体试验而定,原则上至少1个月。
3 试验项目、试验原则及结果判定
3.1 免疫调节作用
3.1.1 试验项目
3.1.1.1 动物试验
3.1.1.1.1 脏器/体重 比值
胸腺/体重 比值
脾脏/体重 比值
3.1.1.1.2 细胞免疫功能测定
小鼠脾淋巴细胞转化试验
迟发型变态反应
3.1.1.1.3 体液免疫功能测定
抗体生成细胞检测
血清溶血素测定
3.1.1.1.4 单核-巨噬细胞功能测定
小鼠碳廓清试验
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验
3.1.1.1.5 NK细胞活性测定
3.1.1.2 人体试食试验
3.1.1.2.1 细胞免疫功能测定
外周血淋巴细胞转化试验
3.1.1.2.2 体液免疫功能试验
单向免疫扩散法测定IgG、IgA、IgM
3.1.1.2.3 非特异性免疫功能测定
吞噬与杀菌试验
3.1.1.2.4 NK细胞活性测定
3.1.2 试验原则
要求选择一组能够全面反映免疫系统各方面功能的试验,其中细胞免疫、体液免疫和单核—巨噬细胞功能三个方面至少各选择1种试验,在确保安全的前提下尽可能进行人体试食试验。
3.1.3 结果判定
在一组试验中,受试物对免疫系统某方面的试验具有增强作用而对其他试验无抑制作用,可以判定该受试物具有该方面的免疫调节效应; 对任何一项免疫试验具有抑制作用可判定该受试物具有免疫抑制效应。
在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核一巨噬细胞功能及NK细胞功能检测中,如有两个以上 (含两个) 功能检测结果阳性,即可判定该受试物具有免疫调节作用。
3.2 延缓衰老作用
3.2.1 试验项目
3.2.1.1 动物试验
3.2.1.1.1 生存试验
小鼠生存试验
大鼠生存试验
果蝇生存试验
3.2.1.1.2 过氧化脂质含量测定
血 (或组织) 中过氧化脂质降解产物丙二醛 (MDA) 含量测定
组织中脂褐质含量测定
3.2.1.1.3 抗氧化酶活力测定
血 (或组织) 中超氧化物歧化酶 (SOD) 活力测定
血 (或组织) 中谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 活力测定
3.2.1.2 人体试食试验
血中过氧化脂质降解产物丙二醛 (MDA) 含量测定
血中超氧化物歧化酶 (SOD) 活力测定
血中谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 活力测定
3.2.2 试验原则
衰老机制比较复杂,迄今尚无一种公认的衰老机制学说,因而无单一、简便、实用的衰老指标可供应用,应采用尽可能多的试验方法,以保证试验结果的可信性。动物试验,除上述生存试验、过氧化脂质含量测定、抗氧化酶活力测定3个方面各选一项必做外,可能时应多选择一些指标,如脑、肝组织中单胺氧化酶 (MAO-B) 活力测定等加以辅助。生存试验是最直观、最可靠的实验方法。果蝇具有生存期短,繁殖快,饲养简便等优点,通常多选果蝇作生存试验,但果蝇种系分类地位与人较远,故必须辅助过氧化脂质含量测定及抗氧化酶活力测定才能判断是否具有延缓衰老作用。生化指标测定应选用老龄鼠,除设老龄对照外,最好同时增设少龄对照,以比较受试物抗氧化的程度,必要时可将动物试验与人体试食试验相结合,综合评价。
3.2.3 结果判定
若大鼠或小鼠生存试验为阳性,即可判定该受试物具有延缓衰老的作用。
若果蝇生存试验,过氧化脂质和抗氧化酶三项指标均为阳性,即可判定该受试物具有延缓衰老的作用。
若过氧化脂质和抗氧化酶两项为阳性,可判定该受试物具有抗氧化作用,并提示可能具有延缓衰老作用。
3.3 改善记忆作用
3.3.1 试验项目
3.3.1.1 动物试验
跳台试验
避暗试验
穿梭箱试验
水迷宫试验
3.3.1.2 人体试食试验
韦氏记忆量表
临床记忆量表
3.3.2 试验原则
3.3.2.1 试验应通过训练前、训练后及重测验前3种不同的给予受试物方法观察其对记忆全过程 (记忆的获得、记忆巩固、记忆再现) 的影响。
3.3.2.2 应采用一组 (2个以上) 行为学试验方法,以保证实验结果的可靠性。
3.3.2.3 人体试食试验为必做项目,并应在动物试验有效的前提下进行。
3.3.2.4 除上述试验项目外,还可以选用嗅觉厌恶试验、味觉厌恶试验、操作式条件反射试验,连续强化程序试验、比率程序试验、间隔程序试验。
3.3.3 结果判定
动物试验两项或两项以上的指标为阳性,且两次或两次以上的重复测试结果一致,可以认为该受试物具有改善该类动物记忆作用。
若人体试食试验结果阳性,则可认为该受试物具有改善人体记忆作用。
3.4 促进生长发育作用
3.4.1 试验项目
3.4.1.1 胎仔情况、活胎数、雌雄比例、死胎数、分娩胎仔总数。
3.4.1.2 体重及食物利用率 记录出生时及生后4、7、14、21、30、60d幼鼠的体重,计算断乳后幼鼠的食物利用率。
3.4.1.3 生理发育指标 记录耳郭分离、门齿萌出、开眼、长毛时间,阴道开放、睾丸下降时间。
3.4.1.4 神经反射指标 平面翻正、前肢抓力、悬崖回避、嗅觉定位、听觉警戒、负趋地性、回旋运动、视觉发育、空中翻正、游泳发育。
3.4.2 试验原则
3.4.2.1 给受试物的时间可根据具体情况选择在母鼠孕期或哺乳期至成年期。
3.4.2.2 在神经反射指标中应选择一组 (5个以上) 的行为学试验方法,以保证结果的可靠性。
3.4.3 结果判定
在胎仔情况、体重及食物利用率、生理发育、神经反射四类指标中有三类以上 (含三类) 指标为阳性,可认为受试物有促进生长发育的作用。
3.5 抗疲劳作用
3.5.1 试验项目
负重游泳试验
爬杆试验
血乳酸
血清尿素氮
肝/肌糖原测定
3.5.2 试验原则
运动试验与生化指标检测相结合。在进行游泳或爬杆试验前,动物应进行初筛。除以上生化指标外,还可检测血糖、乳酸脱氢酶、血红蛋白以及磷酸肌酸等指标。
3.5.3 结果判定
若一项以上 (含一项) 运动试验和两项以上 (含两项) 生化指标为阳性,即可以判断该受试物具有抗疲劳作用。
3.6 减肥作用
3.6.1 减肥原则
3.6.1.1 减除体内多余的脂肪,不单纯以减轻体重为标准。
3.6.1.2 每日营养素的摄入量应基本保证机体正常生命活动的需要。
3.6.1.3 对机体健康无明显损害。
3.6.2 试验项目
3.6.2.1 动物试验
体重
体内脂肪质量 (睾丸及肾周围脂肪垫)
3.6.2.2 人体试食试验
体重、体重指数、腰围、腹围、臀围
体内脂肪含量
3.6.3 试验原则
在进行减肥试验时,除以上指标必测外,还应进行机体营养状况检测、运动耐力测试以及与健康有关的其他指标的观察。人体试食试验为必做项目,动物试验与人体试食试验相结合,综合进行评价。
3.6.4 结果判定
在动物试验中,体重及体内脂肪垫两个指标均为阳性,并且对机体健康无损害,即可初步判定该受试物具有减肥作用。
在人体试食试验中,体内脂肪量显著减少,且对机体健康无明显损害,可判定该受试物具有减肥作用。
3.7 耐缺氧作用
3.7.1 试验项目
小鼠常压耐缺氧实验
3.7.2 结果判定
耐缺氧实验阳性,说明该受试物具有耐缺氧作用。
3.8 抗辐射作用
3.8.1 试验项目
3.8.1.1 亚急性试验
30d存活率或平均存活时间
白细胞总数
3.8.1.2 亚慢性或慢性试验
小鼠睾丸染色体畸变试验
小鼠骨髓细胞微核试验
3.8.2 试验原则
较高剂量一次辐射,选择亚急性试验; 小剂量多次辐射,选择亚慢性或慢性试验。
3.8.3 结果判定
亚急性试验项目中两项结果为阳性,则可判定该受试物对较高剂量一次辐射有拮抗作用。
亚慢性或慢性试验中两项结果为阳性,则可判定该受试物对小剂量多次辐射有拮抗作用。
3.9 抗突变作用
3.9.1 试验项目
Ames试验或V79细胞基因突变试验
小鼠骨髓细胞微核试验
小鼠睾丸染色体畸变试验
3.9.2 试验原则
Ames试验与V79细胞基因突变试验任选一项。采用体内与体外试验相结合的原则。
3.9.3 结果判定
抗突变三项试验中有两项为阳性时,则可判定该受试物具有抗突变作用。
3.10 抑制肿瘤作用
3.10.1 试验项目
动物诱发性肿瘤试验
动物移植性肿瘤试验
免疫功能试验
NK细胞活性测定
单核—巨噬细胞功能测定
3.10.2 试验原则
动物诱发性肿瘤试验及动物移植性肿瘤试验两项试验中任选一项。同时必做两项免疫功能试验。
3.10.3 结果判定
动物诱发性肿瘤试验及动物移植性肿瘤试验两项试验中有一项为阳性,并且对免疫功能无抑制作用,则可判定该受试物具有抑制肿瘤的作用。
3.11 调节血脂作用
3.11.1 试验项目
大鼠脂代谢紊乱模型法
人体试食试验
3.11.2 试验原则
尽可能动物试验和人体试食试验相结合,综合进行评价。
3.11.3 结果判定
大鼠脂代谢紊乱模型法结果为阳性时,可初步判定该受试物具有调节血脂作用。人体试食试验阳性,可判定该受试物对人体具有调节血脂作用。
3.12 改善性功能作用
3.12.1 试验项目
3.12.1.1 交配试验
大鼠交配试验
小鼠交配试验
3.12.1.2 勃起试验
3.12.2 试验原则
评价改善性功能作用,应主要观察是否增强性交功能及阴茎勃起功能。考虑到影响性功能的因素很多,而睾酮对性功能的维持有重要意义,必要时可对睾酮水平进行测定。
3.12.3 结果判定
交配试验 (大、小鼠交配试验任选一项) 或勃起试验中有一项试验结果为阳性,即可判定该受试物具有改善性功能的作用。
3.13 人体试食试验规程
4 评价食品保健作用时需要考虑的因素
4.1 人的可能摄入量 除一般人群的摄入量,还应考虑特殊的和敏感的人群 (如儿童、孕妇及高摄入量人群)
4.2 人体资料 由于存在着动物与人之间的种属差异,在将动物试验结果外推到人时,应尽可能收集人群服用受试物后的效应资料,若体外或体内动物试验未观察到或不易观察到食品的保健效应或观察到不同效应,而有关资料提示对人有保健作用时,在保证安全的前提下,应进行必要的人体试食试验。
4.3 在将本程序所列试验的阳性结果用于评价食品的保健作用时,应考虑结果的重复性和剂量反应关系,并由此找出其最小有作用剂量。
4.4 食品保健作用的检测及评价应由卫生部认定的保健食品功能学检验机构承担。
附加说明:
本程序和检验方法由卫生部卫生监督司提出。
本程序和检验方法由卫生部食品卫生监督检验所 《保健食品功能学评价程序和检验方法》起草小组负责起草。
本程序和检验方法由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。
进行未列入本程序范围的保健食品功能学评价时,应由保健食品的研制生产者提出检验及评价方法,经保健食品功能学检验机构验证及卫生部食品卫生监督检验所组织专家评审,报卫生部批准后方可列入本程序。
本程序中无明确判定方法的人体试食试验结果,可由负责试验单位组织专家组 (至少5人) 按本程序提出的原则要求共同予以评价,并提出判定结果。
一、免疫调节作用检验方法
(一) 动物试验
1 实验动物
选用小鼠。推荐使用近交系小鼠,如C57BL/6J、BALB/C等,6～8周龄,18～22g,雌雄均可,数量为单一性别每组至少10只。
2 给受试物的时间、剂量分组
经口给予受试物15～30d,设3个剂量组和1个对照组。3个剂量组中,其中1个剂量应相当于人推荐摄入量的10倍左右。
3 实验方法
3.1 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验
可任选下列方法之一。
3.1.1 MTT法
3.1.1.1 原理
当T淋巴细胞受ConA、PHA等致分裂原或特异性抗原刺激后发生母细胞转化,活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解酶将MTT(一种淡黄色的唑氮盐) 分解为蓝紫色的结晶 (formazan) 而显色,其光密度值能够反映细胞的增殖情况。
3.1.1.2 仪器和材料
RPMI1640细胞培养液,小牛血清,2-巯基乙醇(2-ME),青霉素,链霉素,刀豆蛋白A(ConA),盐酸,异丙醇,MTT,Hanks液,PBS缓冲液 (pH 7.2～7.4)。
孔径0.074mm筛网,24孔培养板,96孔培养板 (平底),手术器械,二氧化碳培养箱,酶联免疫检测仪,超净工作台。
3.1.1.3 实验步骤
3.1.1.3.1 试剂配制
完全培养液 RPMI1640培养液过滤除菌,用前加入10%小牛血清,1%谷氨酰胺(200mmol/L),青霉素(100U/ml),链霉素 (100μg/L) 及5×10-5mol/L的2-巯基乙醇,用无菌的1mol/L的HCI或1mol/L的NaOH调pH至7.0～7.2,即完全培养液。
ConA液 用双蒸水配制成100μg/ml的溶液,过滤除菌,在低温冰箱 (-20℃) 保存。
无菌Hanks液 用前以3.5%的无菌NaHCO3调pH 7.2～7.4。
MTT液 将5mgMTT溶于1ml pH 7.2的PBS中,现配现用。
酸性异丙醇溶液 98ml丙醇中加入4ml 1mol/L的HCL,临用前配制。
3.1.1.3.2 脾细胞悬液制备
无菌取脾,置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中,用镊子轻轻将脾撕碎,制成单个细胞悬液。经孔径0.074mm筛网过滤,用Hanks液洗3次,每次离心10min (1000r/min)。然后将细胞悬浮于2ml的完全培养液中,用台酚蓝染色计数活细胞数 (应在95%以上),调整细胞浓度为2×106个/ml。
3.1.1.3.3 淋巴细胞增殖反应
将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中,每孔1ml,一孔加50μl ConA液 (相当于5μg/ml),另一孔作为对照,置5%CO2、37℃培养72h。培养结束前4h,每孔轻轻吸去上清液0.7ml,加入0.7ml不含小牛血清的RPMI 1640培养液,同时加入MTT (5mg/ml)50μl/孔,继续培养4h。培养结束后,每孔加入1ml酸性异丙醇,吹打混匀,使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中,每个孔分装3～6孔作为平行样,用酶联免疫检测仪,以570nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入1ml比色杯中,在721分光光度计上比色测定,波长570nm。
3.1.1.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据统计。用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力,受试物组的光密度值显著高于对照组的光密度值,即可判定该项试验结果阳性。
3.1.2 同位素掺入法
3.1.2.1 原理
淋巴细胞在有丝分裂原PHA、ConA等的刺激下,产生增殖反应,DNA和RNA合成明显增加,如在培养液中加入3H-胸腺嘧啶核苷 (3H-TdR),则可被转化中的细胞摄入,测定标记淋巴细胞的放射强度可反映淋巴细胞增殖的程度。
3.1.2.2 仪器和材料
RPMI-1640细胞培养液,小牛血清,2-巯基乙醇 (2-ME),青霉素,链霉素,刀豆蛋白A (ConA), Hanks液, PBS缓冲液 (pH7.2～7.4), 3H-TdR, 闪烁液2, 5-二苯基唑(PPO) 0.5g, 1, 4-双- (5-苯基唑基) 苯 (POPOP) 0.25g, 二甲苯500mL混匀。
孔径0.074mm筛网,96孔培养板(平底),手术器械,二氧化碳培养箱,超净工作台,液体闪烁仪,多头细胞取集器,49型玻璃纤维滤纸。
3.1.2.3 实验步骤
3.1.2.3.1 脾细胞悬液制备
无菌取脾,置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中,用镊子轻轻将脾撕碎,制成单细胞悬液,经孔径0.074mm筛网过滤,用Hanks液洗3次,每次离心10min (100r/min)。然后将细胞悬浮于2ml的完全培养液中,用台酚蓝染色计数活细胞数 (应在95%以上),最后用RPMI1640完全培养液将细胞数调成5×106个/ml。
3.1.2.3.2 淋巴细胞增殖反应
将脾细胞悬液加入到96孔培养板中,200μl/孔,每一份脾细胞悬液分装6个孔。3孔加ConA (5μg/ml),另3孔不加ConA作为对照。置5%CO2、37℃培养72h,培养结束前6h,每孔加入3H-TdR20μl,使其最终浓度为 (3.7～8.5) ×104Bq/mL,用多头细胞取集器将细胞取集于玻璃纤维滤纸上。滤纸片充分干燥后置测量瓶中,加入7ml闪烁液,用液闪仪测定每分钟脉冲数 (cpm)。
3.1.2.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据统计。以每分钟脉冲数 (cpm) 表示增殖程度,用刺激指数 (SI) 来表示:
受试物的SI值显著高于对照组的SI值,即可判定该项试验结果阳性。
3.2 迟发型变态反应 (DTH)
可任选下列方法之一。
3.2.1 二硝基氟苯诱导小鼠DTH (耳肿胀法)
3.2.1.1 原理
二硝基氟苯 (DNFB) 是一种半抗原,将其稀释液涂抹腹壁皮肤后,与皮肤蛋白结合成完全抗原,由此刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。4～7d后再将其涂抹于耳部,使局部产生迟发型变态反应。一般在抗原攻击后24～48h达高峰,故于此时测定其肿胀程度。
3.2.1.2 仪器和材料
DNFB,丙酮,麻油,硫化钡,打孔器。
3.2.1.3 实验步骤
3.2.1.3.1 试剂配制
DNFB溶液应新鲜配制,称取DNFB 50mg,置清洁干燥小瓶中,将预先配好的5ml丙酮麻油溶液(丙酮:麻油=1:1) 倒入小瓶,盖好瓶塞并用胶布密封。混匀后,用250μl注射器通过瓶盖取用。
3.2.1.3.2 致敏
每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛,范围3cm×3cm,用DNFB溶液50μl均匀涂抹致敏。
3.2.1.3.3 DTH的产生与测定
5d后,用DNFB溶液10μl均匀涂抹于小鼠右耳 (两面) 进行攻击。攻击后24h颈椎脱臼处死小鼠,剪下左右耳壳,用打孔器取下直径8mm的耳片,称重。
3.2.1.4 数据处理与结果判定
一般采用方差分析进行数据统计。左右耳质量之差表示DTH的程度。受试物组的差值显著高于与对照组的差值,即可判定该项试验结果阳性。
3.2.1.5 注意事项
操作时应避免DNFB与皮肤接触。
3.2.2 绵羊红细胞 (SRBC) 诱导小鼠DTH(足跖增厚法)
3.2.2.1 原理
SRBC可刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞,4d后,当再以SRBC攻击时,即可见攻击部位出现迟发型变态反应。
3.2.2.2 仪器和材料
游标卡尺 (精密度0.02mm),SRBC,微量注射器 (50μl)。
3.2.2.3 实验步骤
3.2.2.3.1 致敏
小鼠用2%SRBC腹腔或静脉免疫,每只鼠注射0.2ml(约1×106个SRBC)。
3.2.2.3.2 DTH的产生与测定
免疫后4d,测量左后足跖部厚度,然后在测量部位皮下注射20%SRBC,每只鼠20μl (约1×102个SRBC),注射后于24h、48h分别测量左后足跖部厚度,同一部位测量3次,取平均值。
3.2.2.4 数据处理和结果判定
一般采用方差分析进行数据统计。以攻击前后足跖厚度的差值来表示DTH的程度。受试物组的差值显著高于对照组的差值,即可判定该项试验结果阳性。
3.2.2.5 注意事项
测量足跖厚度时,最好由专人来进行。卡尺紧贴足跖部,但不要加压,否则会影响测量结果。
攻击时所用的SRBC要新鲜 (保存期不超过1周)。
3.3 抗体生成细胞检测 (Jeme改良玻片法)
3.3.1 原理
用绵羊红细胞 (SRBC) 免疫过的小鼠脾脏制成细胞悬液,与一定量的SRBC混合,在补体参与下,使抗体分泌细胞周围的SRBC溶解,形成肉眼可见的空斑。溶血空斑数大体可反映抗体分泌细胞数。
3.3.2 仪器和材料
二氧化碳培养箱,恒温水浴,离心机,手术器械,玻片架,孔径0.074mm筛网,SRBC,补体(豚鼠血清),Hanks液,RPMI 1640培养液,SA缓冲液,琼脂糖。
3.3.3 实验步骤
3.3.3.1 SRBC制备
绵羊颈静脉取血,将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中,朝一个方向摇动,以脱纤维,放入4℃冰箱保存备用,可保存2周。
3.3.3.2 制备补体
采集豚鼠血,分离出血清 (至少5只豚鼠的混合血清),使用前将1ml压积SRBC加入到5ml豚鼠血清中,放4℃冰箱30min,经常振荡,离心取上清,分装小瓶,-70℃保存。用时以SA液按1:10稀释。
3.3.3.3 玻片涂膜
在清洁玻片上刷上一薄层琼脂糖 (0.5g琼脂糖加双蒸水至100ml,加热溶解),待干后放片盒可长期保存备用。
3.3.3.4 免疫动物
取羊血,用生理盐水洗涤3次,每次离心 (2000r/min) 10min,计数细胞,每只鼠经腹腔或静脉注射SRBC5×107～2×108个。也可将压积SRBC用生理盐水配成2%的细胞悬液,每只鼠腹腔注射0.2ml。
3.3.3.5 脾细胞悬液制备
将SRBC免疫4～5d后的小鼠颈椎脱臼处死,取出脾脏,放在盛有Hanks液的小平皿内,轻轻撕碎脾脏,制成细胞悬液,经孔径0.074mm筛网过滤,离心 (1000r/min)10min。用Hanks液洗2遍,最后将细胞悬浮在5ml RPMI 1640培养液中,计数细胞,并将细胞浓度调整为5×106个/ml。
3.3.3.6 空斑的测定
将表层培养基 (1g琼脂加双蒸水至150ml) 加热溶解后,放45℃水浴保温,与等量pH7.2～7.42倍浓度的Hanks液混合,分装小试管,每管0.5ml,再向管内加50μl 10% SRBC(用SA液配制),20μl脾细胞悬液 (5×106个/ml),迅速混匀,倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上,待琼脂凝固后,将玻片水平扣放在片架上,放入二氧化碳培养箱中温育1～1.5h后,计数溶血空斑数。
3.3.4 数据处理及结果判定
一般用方差分析进行数据统计,用空斑数/106脾细胞来表示。
受试动物的空斑数显著高于对照组的空斑数,即可判定该项试验结果阳性。
3.4 血清溶血素的测定
可任选下列方法之一。
3.4.1 血凝法
3.4.1.1 原理
用SRBC免疫动物后,产生抗SRBC抗体 (溶血素),利用其凝集SRBC的程度来检测溶血素的水平。
3.4.1.2 仪器和材料
SRBC,生理盐水,微量血凝试验板,离心机。
3.4.1.3 实验步骤
3.4.1.3.1 SRBC制备
绵羊颈静脉取血,将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中,朝一个方向摇动,以脱纤维,放入4℃冰箱保存备用,可保存2周。
3.4.1.3.2 免疫动物及血清分离
取羊血,用生理盐水洗涤3次,每次离心 (2000r/min) 10min。将压积SRBC用生理盐水配成2%的细胞悬液,每只鼠腹腔注射0.2ml进行免疫。4～5d后,摘除眼球取血于离心管内,放置约1h,将凝固血与管壁剥离,使血清充分析出,2000r/min离心10min,收集血清。
3.4.1.3.3 凝集反应
用生理盐水将血清倍比稀释,将不同稀释度的血清分别置于微量血凝试验板内,每孔100μl,再加入100μl0.5%的SRBC悬液,混匀,装入湿润的平盘内加盖,于37℃温箱孵育3h,观察血球凝集程度。
3.4.1.4 数据处理及结果判定
一般用方差分析进行数据统计,血清凝集程度一般分为5级 (0～Ⅳ) 记录,按下式计算抗体积数,受试物组的抗体积数显著高于对照组的抗体积数,即可判定该项试验结果阳性。
抗体积数- (S1+2S2+3S3……nSn)
式中1、2、3…n代表对倍稀释的指数,S代表凝集程度的级别,抗体积数越大,表示血清抗体越高。
0级 红细胞全部下沉,集中在孔底部形成致密的圆点状,四周液体清晰。
Ⅰ级 红细胞大部分沉集在孔底成圆点状,四周有少量凝集的红细胞。
Ⅱ级 凝集的红细胞在孔底形成薄层,中心可以明显见到一个疏松的红点。
Ⅲ级 凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层,中心隐约可见一个小红点。
Ⅳ级 凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层,凝块有时成卷折状。
3.4.1.5 注意事项
血清稀释时要充分混匀。最后一个稀释度应不出现凝集现象。
3.4.2 半数溶血值 (HC50) 的测定
3.4.2.1 原理
用SRBC免疫动物后,产生抗SRBC抗体(溶血素),与SRBC一起孵育,在补体参与下,可发生溶血反应,释放血红蛋白,通过测试血红蛋白含量反映动物血清中溶血素的含量。
3.4.2.2 仪器和材料
721分光光度计,离心机,恒温水浴,SRBC,补体(豚鼠血清),SA缓冲液,都氏试剂 (碳酸氢钠1.0g、高铁氰氧化钾0.2g、氰化钾0.05g,加蒸馏水至1000ml)。
3.4.2.3 实验步骤
3.4.2.3.1 SRBC制备
绵羊颈静脉取血,将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中,朝一个方向摇动,以脱纤维,放入4℃冰箱保存备用,可保存2周。
3.4.2.3.2 制备补体
采集豚鼠血,分离出血清 (至少5只豚鼠的混合血清),使用前将1ml压积SRBC加入到5ml豚鼠血清中,放4℃冰箱30min,经常振荡,离心取上清,分装小瓶,-70℃保存。用时以SA液按1:10稀释。
3.4.2.3.3 免疫动物及血清分离
取羊血,用生理盐水洗涤3次,每次离心 (2000r/min) 10min。将压积SRBC用生理盐水配成2%的细胞悬液,每只鼠腹腔注射0.2ml进行免疫。4～5d后,摘除眼球取血于离心管内,放置约1h,将凝固血与管壁剥离,使血清充分析出,2000r/min离心10min,收集血清。
3.4.2.3.4 溶血反应
取血清用SA缓冲浓稀释 (一般为200～500倍)。将稀释后的血清1ml置试管内,依次加入10% SRBC 0.5ml,补体1ml(用SA液按1:10稀释)。另设不加血清的对照管(以SA液代替)。置37℃恒温水浴中保温15～30min后,冰浴终止反应。2000r/min离心10min。取上清液1ml、都氏试剂3ml于试管内,同时取10% SRBC 0.25ml加都氏试剂4ml于另一支试管内,充分混匀,放置10min后,于540nm处以对照管作空白,分别测定各管光密度值。
3.4.2.4 数据处理及结果判定
一般用方差进行数据统计,溶血素的量以半数溶血值 (HC50) 表示,按下列公式计算,受试物组的HC50显著高于对照组的HC50,即可判定该项试验结果阳性。
3.5 小鼠碳廓清试验
3.5.1 原理
在一定范围内,碳颗粒的清除速率与其剂量呈指函数关系,即吞噬速度与血碳浓度成正比,而与已吞噬的碳粒量成反比。
以血碳浓度对数值为纵坐标,时间为横坐标,两者呈直线关系。此直线斜率 (K)可表示吞噬速率,也可称为未经纠正的吞噬指数。因动物肝、脾质量不等,故K值也不同。为此,一般以纠正的吞噬指数a表示。a反映了每单位组织质量的吞噬活性,公式如下:
3.5.2 仪器和材料
721分光光度计,计时器,血色素吸管,印度墨汁,Na2CO3。
3.5.3 实验步骤
3.5.3.1 溶液配制
注射用墨汁 将印度墨汁原液用生理盐水稀释3～4倍。
Na2CO3溶液 取0.1g Na2CO3,加蒸馏水至100ml。
3.5.3.2 小鼠尾静脉注射稀释的印度墨汁,按每1g体重0.1ml计算。待墨汁注入,立即计时。
3.5.3.3 测定
注入墨汁后,10min分别从内眦静脉丛取血20μl,并将其加到2ml Na2CO3溶液中,用721分光光度计600nm处测光密度值(OD),以Na2CO3溶液作为空白对照。
将小鼠处死,取肝脏和脾脏,用滤纸吸干脏器表面血污,称重。
3.5.4 数据处理及结果判定
一般用方差分析进行数据统计,以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。按下式计算吞噬指数a。受试物组的吞噬指数显著高于对照组的吞噬指数,即可判定该项试验结果阳性。
3.5.5 注意事项
静脉注入碳粒的量、取血时间、取血量一定要准确。
墨汁放置中,碳粒可沉于瓶底,临用前应摇匀。
使用新的墨汁时,应在试验前摸索一个最适墨汁注入量,即正常小鼠在20～30min内不易廓清,而激活的小鼠可明显廓清。
3.6 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验 (半体内法)
3.6.1 原理
巨噬细胞能吞噬鸡红细胞。将上述2种细胞温育后染色,油镜下计算吞噬鸡红细胞的巨噬细胞的百分比,并观察细胞内鸡红细胞的形态。据此判断巨噬细胞的吞噬功能和消化功能。
3.6.2 仪器和材料
显微镜,鸡红细胞,丙酮,甲醇,生理盐水,Giemsa染液。
3.6.3 实验步骤
3.6.3.1 鸡红细胞悬液制备
取鸡血置于有玻璃珠的锥形瓶中,朝一个方向充分摇动,以脱纤维,用生理盐水洗涤2～3次,离心(2000r/min)10min,弃上清液,用生理盐水配成20%的鸡红细胞悬液。
3.6.3.2 吞噬功能测定
每鼠腹腔注射20%鸡红细胞悬液1ml。间隔30min,颈椎脱臼处死动物,将其仰位固定于鼠板上,正中剪开腹壁皮肤,经腹腔注入生理盐水2ml,转动鼠板1min,然后吸出腹腔洗液1ml,平均分滴于2片载玻片上,放入垫有湿纱布的搪瓷盒内,移置37℃孵箱温育30min。孵毕,于生理盐水中漂洗,以除去未贴片细胞。晾干,以1:1丙酮甲醇溶液固定,4% Giemsa磷酸缓冲液染色3min,再用蒸馏水漂洗晾干。
3.6.4 数据处理及结果判定
一般用方差分析进行数据统计,以吞噬百分率或吞噬指数表示小鼠巨噬细胞的吞噬能力。油镜下计数巨噬细胞,每张片计数100个,按下式计算吞噬百分率和吞噬指数。受试物组的吞噬百分率、吞噬指数与对照组吞噬百分率、吞噬指数比较,差异有显著性,即可判定该项试验结果阳性。
在计数时,应同时观察鸡红细胞被消化的程度。借以判定巨噬细胞吞噬与消化功能。通常分为4级:
Ⅰ级 未消化。被吞噬的鸡红细胞完整,胞质浅红或浅黄带绿色,胞核浅紫色。
Ⅱ级 轻度消化。胞质浅黄绿色,胞核固缩呈紫蓝色。
Ⅲ级 重度消化。胞质淡染,胞核淡浅灰色。
Ⅳ级 完全消化。巨噬细胞内仅见形态类似鸡红细胞大小的空泡,边缘整齐,胞核隐约可见。
3.7 NK细胞活性测定
可任选下列方法之一。
3.7.1 乳酸脱氢酶 (LDH) 测定法
3.7.1.1 原理
活细胞的胞浆内含有LDH。正常情况下,LDH不能透过细胞膜,当细胞受到NK细胞的杀伤后,LDH释放到细胞外。LDH可使乳酸锂脱氢,进而使NAD还原成NADH,后者再经递氢体吩嗪二甲酯磷酸盐 (PMS) 还原硝基氯化四氮唑 (INT),INT接受氢被还原成紫红色甲酯类化合物,在酶标仪上用490nm比色测定。
3.7.1.2 仪器和材料
酶标仪,YAC细胞仪,Hanks液 (pH 7.2～7.4),RPMI 1640完全培养液,乳酸锂,硝基氯化四氮唑 (INT),吩嗪二甲酯磷酸盐 (PMS),NAD,0.2mol/L的Tris-HCL缓冲液(pH8.2),1%NP40。
3.7.1.3 实验步骤
3.7.1.3.1 基质液的配制
乳酸锂5×10-2mol/L
硝基氯化四氮唑 (INT) 6.6×10-4mol/L
吩嗪二甲酯磷酸盐 (PMS) 2.8×10-4mol/L
氯化型辅酶I (NAD) 1.3×10-3mol/L
将上述试剂溶于0.2mol/L的Tris缓冲液中 (pH 8.2)
3.7.1.3.2 靶细胞的传代 (YAC-1细胞)
试验前24h将靶细胞进行传代培养。应用前以Hanks液洗3次,用RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为1×105个/ml。
3.7.1.3.3 脾细胞悬液的制备 (效应细胞)
无菌取脾,置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中,用镊子轻轻将脾撕碎,制成单细胞悬液,经孔径0.074mm筛网过滤,用Hanks液洗3次,每次离心10min (1000r/min)。然后将细胞液悬浮于2ml的完全培养液中,用台酚蓝染色计数活细胞数 (应在95%以上),最后用RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为5×106个/ml。
3.7.1.3.4 NK细胞活性检测
取靶细胞和效应细胞各100μl(效靶比50:1),加入U型96孔培养板,靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl,靶细胞最大释放孔加靶细胞和1% NP40各100μl,上述各项均设3个复孔,于37℃ 5% CO2培养箱中培养4h,然后将96孔培养板以1500r/min离心5min,每孔吸取上清液100μl置平底96孔培养板中,同时加入LDH基质液100μl,反应3min,每孔加入1mol/L的HCl 30μl,在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)。
3.7.1.4 数据处理及结果判定
一般用方差分析进行数据统计。按下式计算NK细胞活性。受试物组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性,即可判定该项试验结果阳性。
3.7.1.5 注意事项
靶细胞和效应细胞必须新鲜,细胞存活率应大于95%。
比色时环境温度应保持恒定。
LDH基质液应临用前配制。
在一定范围内,NK细胞活性与效靶比值成正比,一般效靶比值不应超过100。
3.7.2 同位素3H-TdR测定法
3.7.2.1 原理
将用同位素3H-TdR标记的靶细胞与淋巴细胞共同培养时,靶细胞可被NK细胞杀伤。同位素便从被杀伤的靶细胞中释放出来,其释放的量与NK细胞活性成正比。通过测定靶细胞3H-TdR的释放率即可反映NK细胞的活性。
3.7.2.2 仪器和材料
液体闪烁仪,多头细胞取集器,二氧化碳培养箱,3H-TdR,RPMI 1640完全培养液,Hanks液 (pH7.2～7.4),YAC-1细胞,Triton×-100。
3.7.2.3 实验步骤
3.7.2.3.1 靶细胞的标记
取传代后24h生长良好的YAC-1细胞 (存活率>95%) 按1×106/ml YAC-1细胞悬液加3H-TdR 10 uCi进行标记,于37℃5% CO2培养箱中培养2h,每30min振荡1次。标记后的细胞用培养液洗涤3次,重悬于培养液中,使细胞浓度为1×105个/ml。
3.7.2.3.2 脾细胞悬液的制备 (效应细胞)
无菌取脾,置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中,用镊子轻轻将脾撕碎,制成单细胞悬液,经孔径0.074mm筛网过滤,用Hanks液洗3次,每次离心10min (1000r/min)。然后将细胞悬浮于2ml的完全培养液中,用台酚蓝染色计数活细胞数 (应在95%以上),最后用RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为1×107个/ml。
3.7.2.3.3 NK细胞活性测定
在96孔培养板中每孔加100μl标记的靶细胞,试验孔加100μl效应细胞,空白对照孔加100μl培养液,最大释放孔加100μl25% Triton×-100。每个样品设3个复孔,置5% CO2 37℃培养箱内温育4h,用多头细胞收集器将细胞收集在玻璃纤维滤纸上,用液体闪烁仪进行测量。
3.7.2.4 数据处理及结果判定
一般用方差分析进行数据统计。按下式计算NK细胞活性。受试物组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性,即可判定该项试验结果阳性。
(二) 人体试食试验
1 人外周血淋巴细胞转化试验(MTT法)
1.1 原理
当T淋巴细胞受ConA、PHA等致分裂原或特异性抗原刺激后发生母细胞转化,活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解酶将MTT(一种淡黄色的唑氮盐) 分解为蓝紫色的结晶而显色,其光密度值能够反映细胞的增殖情况。
1.2 仪器和材料
肝素,淋巴细胞分离液,PHA,RPMI 1640培养液,小牛血清,青霉素,链霉素,盐酸,异丙醇,MTT,Hanks液,二氧化碳培养箱,酶联免疫检测仪。
1.3 实验步骤
1.3.1 淋巴细胞的分离
取肝素抗凝血加等量Hanks液稀释,混匀。于试管内先加入2～2.5ml淋巴细胞分离液,用毛细吸管吸取上述已稀释的血液,沿管壁轻轻叠加到分离液上方,形成清晰界面。置水平式离心机上,2500r/min离心10min,即可出现分层。用毛细滴管沿管壁伸入乳白色细胞层中,将此层细胞悬液吸出,用Hanks液洗涤3次 (2000r/min,10min)。最后用RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为2×106个/ml。
1.3.2 淋巴细胞增殖反应
将淋巴细胞悬液分两孔加入到24孔培养板中,每孔1ml,一孔加PHA 10ug,另一孔作为对照。置5%CO237℃培养72h。培养结束前4h,每孔轻轻吸去上清液0.7ml,加入0.7ml不含小牛血清的RPMI 1640培养液,同时加入MTT (5mg/mL) 50μl/孔,继续培养4h。培养结束后,每孔加入1ml酸性异丙醇,吹打混匀,使紫色结晶完全溶解。然后分装96孔培养板中,每个孔分装3～6孔作为平行样,以570nm波长测定光密度值。
1.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据统计。以光密度值代表淋巴细胞增殖能力。受试物组的光密度值显著高于对照组的光密度值,即可判定该项试验结果阳性。
2 单向免疫扩散法测定 IgG、IgA、IgM
2.1 原理
将抗Ig血清均匀地分散于琼脂内,待凝固后于其上打孔,再将抗原 (相应的Ig) 加入孔中,使其向四周扩散,抗原抗体复合物形成的沉淀环的直径与抗原的浓度成正比。
2.2 仪器和材料
测量尺,商品化的单向免疫扩散板。
2.3 实验步骤
静脉取血,分离血清。将血清加入免疫扩散板的孔内,观察扩散情况,测量沉淀环的直径,从标准曲线中求出IgG、IgA、IgM的量。
2.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据统计。受试物组的Ig量显著高于对照组的Ig量,即可判定该项试验结果阳性。
3 吞噬与杀菌试验(白色念珠菌法)
3.1 原理
白细胞与白色念珠菌共育后加入美蓝染液作活体染色,可观察白细胞对白色念珠菌的吞噬情况。正常情况下,活菌对染料发生排斥,如白色念珠菌被染成蓝色,说明已被吞噬细胞吞噬并杀死。
3.2 仪器和材料
显微镜,肝素,右旋糖酐,RPMI 1640培养液,美蓝。
3.3 实验步骤
3.3.1 白细胞悬液制备
肝素抗凝血加等容积60g/L右旋糖酐或30g/L明胶,充分混匀后静置20～30min,吸取血浆层,1000r/min离心10min,弃上清液。用8.3g/L NH4Cl低渗溶液破坏残留的红细胞,离心,弃上清液。用含10%新鲜人AB型混合血清的PPMI 1640培养液配成每油镜视野3～4个细胞。
3.3.2 白色念珠菌液制备
自沙氏斜面培养基上挑取新生长的白色念珠菌菌落半个,于0.5ml生理盐水中混悬,配成约6×106/ml浓度。
3.3.3 美蓝染液制备
取美蓝20mg溶于10g/L碳酸钠水溶液中,滤纸过滤后使用。
3.3.4 吞噬杀菌功能检测
取白细胞悬液0.5ml,加白色念珠菌液0.5ml,充分混匀后将试管加塞,37℃温育45min。取出后2000r/min离心10min,弃上清液 (保留少许),混匀沉淀后,取沉淀1滴置玻片上,加美蓝染液1滴混匀,覆以盖玻片。5min后油镜检查白细胞内吞噬的白色念珠菌。淡蓝色为死菌,未着色者为活菌。
3.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据统计。按下式计算吞噬率和杀菌率。受试物组吞噬率和杀菌率显著高于对照组的吞噬率和杀菌率,即可判定该项试验结果阳性。
4 NK细胞活性测定
4.1 原理
将用同位素51Cr标记的靶细胞与淋巴细胞共同培养时,靶细胞可被NK细胞杀伤,同位素便从这些被破坏的靶细胞中释放出来,测定51Cr的释放量即可了解到NK细胞的活性。
4.2 仪器和材料
γ计数仪,二氧化碳培养箱,Na251 CrO4,RPMI1640完全培养液,Hanks液 (pH7.2～7.4),K 562细胞,SDS。
4.3 实验步骤
4.3.1 淋巴细胞的分离 (效应细胞)
取肝素抗凝血加等量Hanks液稀释,混匀。于试管内先加入2～2.5ml淋巴细胞分离液,用毛细吸管吸取上述已稀释的血液沿管壁轻轻叠加到分离液上方,形成清晰界面。置水平离心机上,2500r/min离心10min,即可出现分层。用毛细滴管沿管壁伸入乳白色细胞层中,将此层细胞悬液吸出,用Hanks液洗涤3次 2000r/min离心10min)。最后用RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为5×106个/ml。
4.3.2 标记靶细胞
以K562细胞株作为靶细胞,取传代的K562细胞4×106个/0.5ml,加100μCiNa251CrO4,5% CO237℃培养1.5h,时时摇动,离心弃上清液,用培养液洗3次,调整其细胞浓度为1×105个/ml。
4.3.3 NK细胞活性测定
试验管: 效应细胞和标记靶细胞各0.2ml,效靶比为50:1。
自然释放管: 完全培养液0.2ml,标记靶细胞0.2ml。
最大释放管: 标记靶细胞0.2ml,20g/L SDS 0.2ml。
以上各管分别设3个复管,5% CO237℃培养4h后,各管分别加入冷的Hanks液0.6ml,2500×g离心5min,各取0.5ml上清液,用γ计数仪测各管的cpm。
4.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据处理。按下式计算NK细胞活性。受试物组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性,即可判定该项试验结果阳性。
二、延缓衰老作用检验方法
(一) 动物试验
1 生存试验
1.1 原理
利用生物的整个生存过程来观察营养、受试物、环境等外界因素对其寿命的影响。
1.2 基本要求
1.2.1 所选择的实验动物要具有试验周期短,饲养管理简便,重复性好等优点。
1.2.2 实验动物保持原有的正常生存条件。不能片面地追求缩短时间,否则生长发育不正常,难以得出可靠结果。
1.2.3 在整个生存试验中必须统计动物进食量。受试物组的进食量不能低于对照组,尽量使各组进食量保持一致。限制体重能延长一些动物的寿命,这一现象称为Mecay效应,生存试验中忽视这一效应往往影响结果的判断。
1.2.4 实验环境的温度必须保持在一定范围内(24～26℃)。变温动物(果蝇)随温度降低寿命延长,而恒温动物(大、小鼠)寿命则缩短。忽视温度的变化,影响结果的判断。
1.2.5 为缩短实验周期,可选用老年动物,或根据25%、50%动物死亡时间来估计实验结果 (一般要求样本数大)。
1.3 实验方法
1.3.1 小鼠生存试验
1.3.1.1 实验动物
小鼠属于啮齿目 (Rodentia) 鼠科 (Muridae) 小鼠属动物,寿命2～3年,食性、代谢过程以及生长发育、繁殖、衰老阶段均与人类相似,而且体型小,性情温顺,饲料消耗少,易于饲养管理,对多种病原体容易感染,实验的准确性和重复性好。选用12月龄小鼠,每组40只,雌雄各半。
1.3.1.2 剂量分组
随机分成1个对照组和3个剂量组,人每公斤体重日推荐摄入量10倍作为其中1个剂量,另2个剂量根据受试物的具体情况,在这个剂量基础上,上下浮动。
1.3.1.3 小鼠饲料
麦粉18%,面粉18%,黄豆粉18%,玉米粉18%,米粉18%,鱼粉8%,骨粉1%,酵母粉1%。
1.3.1.4 实验步骤
取160只小鼠,饲养在25℃的室温和50%～70%相对湿度下,自然采光,经常通风换气,喂以常规饲料。一般采用灌胃法、掺入饲料法或加入饮水法给予受试物,从12月龄开始给予,直至死亡。然后每天统计其死亡鼠数,直至全部自然死亡。比较受试物组与对照组的平均寿命和最高寿命,画出其生存曲线图,统计半数动物死亡天数。
1.3.1.5 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据处理,并按动物性别分别统计。受试物组与对照组比较,寿命延长经统计差异有显著性 (P <0.05),判定该受试物小鼠生存试验阳性。
1.3.2 大鼠生存试验
1.3.2.1 实验动物
大鼠(Rattus norvegicus)属于啮齿目(Rodentia)鼠科(Muridae)大鼠属动物,寿命2.5～3年,食性、代谢过程以及生长发育、繁殖、衰老阶段均与人类相近,具有繁殖快,抗病力强,容易饲养,便于管理等特点。选用18月龄大鼠。每组30只,雌雄各半。
1.3.2.2 剂量分组
随机分成1个对照组和3个剂量组,人每公斤体重日推荐摄入量5倍作为其中1个剂量,另2个剂量根据受试物的具体情况,在这个剂量基础上,上下浮动。
1.3.2.3 大鼠饲料
小米粉20%,机米粉24%,麦麸5%,鱼粉8%,黄豆粉5.5%,蛋黄粉3%,绿豆粉5%,酵母粉2%,小米0.5%,鱼肝油2%,麻油3%,骨粉1%,食盐1%。
1.3.2.4 实验步骤
取120只大鼠,饲养在 (21±1)℃的室温和50%～70%相对湿度下,自然采光,配有通风设备,动物笼子用金属的。要防止其食粪习性影响实验结果,一般采用灌胃法、掺入饲料法、加入饮水法给予受试物,从18月龄开始给予,直至死亡。每天观察并记录其死亡数,直至全部自然死亡。比较受试物组与对照组的平均寿命和最高寿命,画出其生存曲线图,统计半数动物死亡天数。
1.3.2.5 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据处理,并按动物性别分别统计。受试物组与对照组比较,寿命延长经统计差异有显著性 (P<0.05),判定该受试物大鼠生存试验阳性。
1.3.3 果蝇生存试验
1.3.3.1 实验动物
果蝇是双翅目果蝇属昆虫,900多种,通常选用黑腹果蝇(drosophila melanogaster)。其许多代谢途径、生理学功能和发育分段同哺乳动物基本相似,具有与人类相似的生长发育、繁殖和衰老阶段。
果蝇整个生命周期包括卵—幼虫—蛹—成虫4个阶段,25℃时从卵到成虫为10.2d。成虫寿命,雄性为53.5d,雌性为60.1d。果蝇性别区分,幼虫期较难,成虫区分见表1。
表1
性别 | 体型 | 腹部环节 | 腹部末端 | 性梳* |
雄 雌 | 较小 较大 | 5节 7节 | 钝而圆、色深 尖、色浅 | 有 无 |
* 性梳指第一对脚的跗节前端表面的黑色鬃毛流苏,用此标志区分性别更为准确。
1.3.3.2 仪器和试剂
暗温箱 (20～25℃,湿度60%～65%),培养指管 (平底) 1.3cm×10cm或3cm×13cm,乙醚,苯甲酸。
1.3.3.3 果蝇基础饲料及配制方法 (以100g饲料为例)
玉米粉10%,红糖13.5%,琼脂1.5%,苯甲酸0.15%,干酵母粉1%,水73.85%,自然pH。
1.3.3.3.1 将10g玉米粉倒入250ml烧杯中,加自来水36ml,在电炉上加热调成糊状。
1.3.3.3.2 将琼脂1.5g放入100ml烧杯中,加自来水40ml,在电炉上煮沸使充分溶解,加红糖13.5g、苯甲酸0.15g(用3ml95%乙醇溶解) 或丙酸1ml,煮沸溶解。
1.3.3.3.3 将上述两者混合,煮沸,称重。如饲料质量不足99g,则补加100℃热水至总质量99g。立即加入干酵母粉1.0g,充分调匀。
1.3.3.4 受试物处理
受试物加入饲料之前,必须用水或其他有机溶剂溶解。不易溶解的物质,必须用乳钵研磨成粉末,越细越好,将粉末加入溶解的饲料中,充分调匀,也可先称重,然后加15倍水在室温下浸泡4h,再在100℃水浴锅中处理1h,用定量滤纸抽滤,滤液浓缩到一定程度后,按需要分别加入基础饲料中。试验样品加入前后,必须注意饲料pH变化,一般情况下应使各组pH值保持一致。
1.3.3.5 剂量分组
设1个空白对照组和3个剂量组,各剂量组饲料含受试物浓度分别为0.2%、1%、5%。
1.3.3.6 实验步骤
卵、幼虫、蛹及成虫均培养在 (25±1)℃,65%相对湿度的暗温箱中。将常用基础饲料煮成粥后分装于无菌培养指管 (3.0cm×13cm) 中,每支培养管内基础饲料厚度为0.5～1.0cm,用双层无菌白棉布封口,成虫基础饲料每4d更换1次,将培养管平放在恒温箱内饲养。收集10h内孵出的成虫进行分组,在此时间范围内孵化的果蝇均未交配。把蘸有乙醚的脱脂棉球放入带有内径1mm针头的10ml注射器内,来回抽动,将乙醚蒸气用注射器打入盛有果蝇的指管中,严防液态乙醚打入,待果蝇完全麻醉后倒出称重分组,选择个体大小相近的果蝇,每管25只,雌雄分养,每组雌雄果蝇各100只,在成虫期给受试物,受试物掺入基础饲料中,并保持各组pH值一致。每天定时3次统计果蝇存活数、死亡数,直到全部死亡。每组最后死亡的10只果蝇成虫存活天数的平均数为该组的最高寿命。试验结束,计算平均寿命和最高寿命以及半数死亡时间。将观察结果填于表2。
表2
组别 | 性别 | 样本数 | 平均体重/μg | 半数死亡时间/d | 最高寿命/d | 平均寿命/d |
对照 | ♂ ♀ | |||||
0.2% | ♂ ♀ | |||||
1% | ♂ ♀ | |||||
5% | ♂ ♀ |
1.3.3.7 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据处理,并按动物性别分别统计。受试物组与对照组比较,寿命延长经统计差异有显著性 (P<0.05),判定该受试物果蝇生存试验阳性。
1.3.3.8 注意事项
1.3.3.8.1 新羽化的成虫,个体越大,平均寿命与最高寿命越长。因此分组时要尽量选择大小均一的样本。
1.3.3.8.2 培养管在使用前一定要烤干。
1.3.3.8.3 培养管一定要平放,采用透气材料封口,要及时清除死蝇。
1.3.3.8.4 为避免感染杂菌,培养容器要消毒,无菌操作,培养环境定期用杀菌剂处理,夏天使用的饲料,苯甲酸含量提高到0.4%,也可在饲料中加入抗菌素。
2 过氧化脂质(LPO)含量测定
2.1 原理
脂质过氧化可以形成丙二醛、乙烷、共轭二烯、荧光产物及化学发光的物质。如果这些产物在体液和组织中的含量增多,则表明体内脂质过氧化反应增强。
2.2 实验动物
种系 选用封闭群大鼠或小鼠。
年龄 原则上用老龄鼠,通常选用20月龄大鼠,15月龄小鼠 (相当于人60岁左右) 这一年龄段,作延缓衰老生化指标测定。
性别 雌雄均可,单一性别每组大鼠不少于8只,小鼠不少于10只。
分组 随机分为3个剂量组,1个老龄对照组,最好增设1个少龄对照组 (大鼠3月龄,小鼠8周),每组大鼠8只,小鼠10只。
剂量 人每公斤体重日推荐摄入量小鼠10倍,大鼠5倍,为其中1个剂量,另外2个剂量根据受试物的具体情况,在这个剂量基础上,上下浮动。
给受试物的时间 原则上1个月,必要时可延长至3个月。
途径 根据受试物性质而定,一般采用灌胃法、掺入饲料法、加入饮水法。
2.3 实验方法
2.3.1 血 (或组织) 中过氧化脂质降解产物丙二醛 (MDA) 含量测定
2.3.1.1 原理
MDA (malondialdehyde) 是细胞膜脂质过氧化的终产物之一,测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。1个丙二醛 (MDA) 分子与2个硫代巴比妥酸 (TBA) 分子在酸性条件下共热,形成粉红色复合物。以波长515nm为激发光,在553nm有最强荧光强度。可用荧光法进行微量测定。
2.3.1.2 仪器和试剂
仪器 荧光分光光度计,微量加样器,恒温水浴锅,普通离心机,混旋器,具塞离心管,组织匀浆器。
试剂6.7g/L硫代巴比妥酸 (TBA) -冰醋酸 (1:1) 混合液
10mmol/L四乙氧基丙烷(贮备液,4℃保存3个月),临用前用甲醇稀释成10nmol/ml
1/6mol/L硫酸
100g/L磷钨酸
正丁醇
无水乙醇
9g/L生理盐水
以上所用玻璃器皿均需经50%硝酸浸泡24h后,再经蒸馏水、双蒸水淋洗干燥。试剂 (选AR级) 最好用双蒸水配制。
2.3.1.3 实验步骤
2.3.1.3.1 样品制备
全血样品 取血50μl加入1ml生理盐水,2000r/min离心10min,取上清液待测。
血清样品 取血0.5ml室温静置10min,2000r/min离心10min,取上清液待测。
组织匀浆样品 取一定量的所需脏器,生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎,置玻璃匀浆器中,加入冷生理盐水,以20000r/min匀浆10s,间歇30s,反复进行3次,制成10g/100ml组织匀浆,4000r/min离心5～10min,取上清液待测。
2.3.1.3.2 标准曲线制作
将10nmol/ml四乙氧基丙烷,用双蒸水稀释成0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、5nmol/ml,分别取1ml加入TBA-冰醋酸 (1:1) 混合液1ml→混匀,沸水浴75min→流水冷却至室温→5ml正丁醇振荡抽提2min→3000r/min离心10min→取上清液 (正丁醇层) 测荧光强度(狭缝10nm,波长: 激发光515nm,发射光553nm)。以四乙氧基丙烷浓度为横坐标,荧光强度为纵坐标作图。
2.3.1.3.3 样品测定
血清20μl(或全血上清液0.5ml,或组织匀浆上清液0.1ml)→加1/6mol/L硫酸4ml、100g/L磷钨酸0.5ml摇匀,室温放置5min→3000r/min离心10min,弃上清液→沉淀加1/6mol/L硫酸2ml、100g/L磷钨酸0.3ml摇匀,室温放置5min→3000r/min离心10min,弃上清液→沉淀用1ml蒸馏水振摇2min,再加TBA-冰醋酸 (1:1) 混合液1ml摇匀→95～100℃水浴75min(勿动!)→准时取出,流水冷却至室温→正丁醇5ml振荡抽提2min→3000r/min离心10min→取上清液 (正丁醇层)4ml测定荧光强度 (若出现混浊,可加1滴无水乙醇)。波长: 发光515nm,发射光553nm,狭缝10nm,四乙氧基丙烷0.5nmol/ml为标准对照。
2.3.1.3.4 计算
测得荧光强度在标准曲线上可查得相应的MDA含量,然后换算成每1ml血清 (血液) 或每1mg组织中的过氧化脂质的含量。
公式:
式中F——0.5nmol/ml四乙氧基丙烷荧光度
f——样品荧光度
2.3.1.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据处理。受试物组与老龄对照组比较,过氧化脂质含量降低经统计差异有显著性 (P<0.05),判定该受试物有降低脂质过氧化作用,试验结果阳性。若受试物组过氧化脂质含量降低接近少龄对照组,两者统计差异无显著性 (P>0.05),则说明该受试物具有较强的降低脂质过氧化作用。
2.3.2 组织中脂褐质 (Lipofasci) 含量测定
2.3.2.1 原理
脂褐素是丙二醛与游离氨基的物质 (如磷脂酰乙醇胺、蛋白质及核酸) 交联而生成的具有荧光的化合物,即schiff碱,可以用氯仿与甲醇的混合液作萃取剂,将其从组织中提取出来进行测定,测定schiff碱的含量,可知道细胞被自由基损伤的程度,间接反映体内脂质过氧化水平。
2.3.2.2 仪器和试剂
仪器 荧光分光光度计,组织匀浆器,离心机,紫外灯,恒温水浴锅。
试剂 氯仿(AR)
甲醇 (AR)
氯仿甲醇混合液 (2:1) (新鲜配制)
0.1mol/L硫酸
硫酸奎宁标准液 (0.1μg/ml、0.1mol/L硫酸)
以上所用玻璃器皿均需经50%硝酸浸泡24h后,再经蒸馏水、双蒸水淋洗干燥。
2.3.2.3 实验步骤
取组织200mg,加入2:1氯仿甲醇混合液4ml,用匀浆器在45℃水浴中2500r/min匀化1min,制成以氯仿甲醇混合液为介质的5%匀浆。随后加入4ml蒸馏水,以2000r/min(匀浆器) 充分混合1min,除去黄素干扰物,3000r/min离心10min后样品分为3层,上层为水相,中层为组织,下层为氯仿甲醇相。小心吸去水层,沿管壁穿过中层,将下层氯仿甲醇液取出,不可将水混入提取液中,若水混入提取液中,应再离心去除水。向氯仿甲醇提取液中加入甲醇0.2ml,轻轻振荡混匀,使之清澈透明,置紫外灯下照射30s,倒入石英杯中,测定荧光强度。
以硫酸奎宁 (0.1μg/ml、0.1mol/L硫酸) 为标准对照,在狭缝4.4nm,灵敏度3.6,激发波长360nm,发射波长450nm,其荧光强度为55～60U,在该条件下测定样品荧光强度。氯仿甲醇混合液为空白对照。
计算
2.3.2.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据处理。受试物组与老龄对照组比较,脂褐质含量降低经统计差异有显著性(P<0.05),判定该受试物有降低脂质过氧化作用,试验结果阳性。若受试物组脂褐质含量降低接近少龄对照组,两者统计差异无显著性 (P>0.05),则说明该受试物具有较强的降低脂质过氧化作用。
2.3.2.5 注意事项
2.3.2.5.1 吸取氯仿层时要非常小心,以免带入组织颗粒和水,影响荧光测定。
2.3.2.5.2 荧光化合物的全部化学性质与特点不清楚,有些正常生化物质,如视黄醛和黄素类化合物也具有类似荧光产物的荧光光谱,黄素类物质是水溶性物质,水洗氯仿甲醇混合液,便可除去; 视黄醛是脂溶性的,在氯仿中经紫外线照射后迅速降解,其他一些共轭多烯化合物,用紫外线照射也可除去。
2.3.2.5.3 丙二醛与自由氨基的交联反应较为缓慢,Schiff碱的形成是一个长时间的过程,不能立即反映自由基损伤反应的变化。因此,给予受试物的时间要长,一般2～3个月,长者可达6个月以上。
3 抗氧化酶含量及活力测定
3.1 原理
SOD催化超氧阴离子自由基 (O2·-)生成H2O2,再由其他抗氧化酶如谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)和过氧化氢酶作用生成水,这样可以清除O2·-对细胞的毒害作用。SOD、GSH-Px在动物某些器官和人体血红细胞中的含量均有明显的增龄变化,酶活性与生物年龄的增长成反比,消除自由基的能力与酶活性成正比。
3.2 实验动物
种系 选用封闭群大鼠或小鼠。
年龄 原则上用老龄鼠,通常选用20月龄大鼠,15月龄小鼠 (相当于人60岁左右) 这一年龄段,作延缓衰老生化指标测定。
性别 雌雄均可,单一性别每组大鼠不少于8只,小鼠不少于10只。
分组 随机分为3个剂量组,1个老龄对照组,最好增设1个少龄对照组 (大鼠3月龄,小鼠8周),每组大鼠8只,小鼠10只。
剂量 人每公斤体重日推荐摄入量小鼠10倍,大鼠5倍,为其中1个剂量,另外2个剂量根据受试物的具体情况,在这个剂量基础上,上下浮动。
给受试物的时间原则上1个月,必要时可延长至3个月。
途径 根据受试物性质而定,一般采用灌胃法、掺入饲料法、加入饮水法。
3.3 实验方法
3.3.1 血 (或组织) 中超氧化物歧化酶 (SOD) 活力及含量测定
可任选下列方法之一。
3.3.1.1 化学发光法
3.3.1.1.1 原理
黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化底物黄嘌呤或次黄嘌呤氧化生成尿酸的同时产生O2·-,O2·-与化学发光剂鲁米诺 (氨基苯二酰肼) 反应生成激发态的中间物,当中间物返回基态时,以光辐射的能量产生发光现象,由于SOD能清除O2·-,所以抑制鲁米诺的化学发光,其抑制程度与酶活力大小有关。
3.3.1.1.2 仪器和试剂
仪器 生物化学发光仪,微量加样器。
试剂①0.05mol/L碳酸盐缓冲液 (含1×10-4mol/L EDTA) pH 10.2
Na2CO3 3.68g
NaHCO3 1.28g
EDTA 37.22mg
加双蒸水至1000ml,4℃储存1～2月。
②0.05mol/L磷酸盐缓冲液 (含1×10-4mol/L EDTA) pH 7.8
K2HPO4 7.970g
KH2PO4 0.579g
EDTA 37.22mg
加双蒸水至1000ml,室温放置1周。
③1×10-4mol/L黄嘌呤(xanthine)黄嘌呤3.8mg加0.05mol/L碳酸盐缓冲液pH 10.2至250ml,新鲜配制。
④1×10-4mol/L鲁米诺(Luminol)鲁米诺4.45mg加0.05mol/L碳酸盐缓冲液pH10.2至250ml,新鲜配制。
⑤黄嘌呤-鲁米诺混合液 (1:1)
用前新鲜配制。
⑥黄嘌呤氧化酶* (0.1mg/ml) 黄嘌呤氧化酶 (46mg/ml) 22μl加入0.05mol/L磷酸盐缓冲液pH 7.8 10ml,用前新鲜配制。
* 黄嘌呤氧化酶也可根据酶活性大小配成适当浓度,以在发光仪上空白产生300～400mV的读数为宜。
⑦超氧化物歧化酶标准品
3.3.1.1.3 实验步骤
SOD标准曲线制作 将标准品SOD用0.05mol/L磷酸盐缓冲液 (pH 7.8) 稀释成2、4、6、8、10ng/ml,取不同浓度SOD液10μl,加黄嘌呤氧化酶10μl,再加鲁米诺-黄嘌呤混合液980μl,测反应1min后6s的发光值 (mV),空白对照用0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.8)10μl代替,以空白对照的发光强度为100%,抑制发光程度为纵坐标,SOD浓度为横坐标,绘制曲线,求出抑制50%发光程度时SOD的浓度C50 (ng/ml)。
样品测定 取鼠血10μl加入到0.5ml双蒸水中,充分振摇使之溶血 (1:50),待测。
表3
试剂 | 样品管 | 空白管 |
溶血液/μl | 10 | |
0.05mol/L磷酸盐缓冲液/μl | 10 | |
黄嘌呤氧化酶/μl 鲁米诺-黄嘌呤混合液/μl | 10 980 | 10 980 |
按表3顺序加样,混匀后立即计时,测1min后6s的发光值(mV) 或积分值。
计算 在25℃条件下,抑制50%发光程度时所需的SOD的浓度C50(ng/ml)为一个活力单位。
根据发光抑制率在标准曲线上查出样品的SOD含量(ng/ml)
3.3.1.1.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据处理。受试物组与老龄对照组比较,SOD活力升高经统计差异有显著性 (P <0.05),判定该受试物有升高SOD作用,试验结果阳性。若受试物组SOD升高接近少龄对照组,两者统计差异无显著性 (P>0.05),则说明该受试物具有较强的升高SOD作用。
3.3.1.1.5 注意事项
溶血液及黄嘌呤氧化酶的加样量可根据酶活性大小调整,但每次试验各组加样量一致,最终反应体积为1ml,可在加混合液前用蒸馏水补齐。
SOD活力测定方法灵敏度的高低取决于pH和O2·-稳态浓度(即黄嘌呤氧化酶的量)。
3.3.1.2 羟胺法
3.3.1.2.1 原理
O2·-氧化羟基的最终产物为亚硝酸盐,后者在对氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈现紫色,在波长530nm处有极大吸收峰,可用发光光度法进行测定,当SOD消除O2·-后,亚硝酸盐减少。
3.3.1.2.2 仪器和试剂
仪器 721分光光度计,离心机,恒温水浴,匀浆器。
试剂 1/15mol/L磷酸盐缓冲液pH 7.8
10mmol/L盐酸羟胺 盐酸羟胺6.95mg,加水至10ml。
7.5mmol/L黄嘌呤 黄嘌呤11.41mg,加水至10ml。
0.023U/ml黄嘌呤氧化酶 25U/0.9ml黄嘌呤氧化酶8.4μl,加pH 7.8磷酸盐缓冲液至10ml。
10g/L甲萘胺
3.3g/L对氨基苯磺酸
3g/L磺基水杨酸
SOD标准品
三氯甲烷
95%乙醇
3.3.1.2.3 实验步骤
红细胞抽提液制备 50μl全血冲入0.5ml生理盐水,2000r/min离心3min,弃上清液,加冰冷的双蒸水0.2ml混匀,加入95%乙醇0.1ml,振荡30s,加入三氯甲烷0.1mL。
快速混合器抽提1min,4000r/min离心3min,分层,上层为SOD抽提液,中层为血红蛋白沉淀物,下层为三氯甲烷,记录上清液体积待测。
组织匀浆的制备 剪取一定量的所需脏器,生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎,至玻璃匀浆器中加入冷生理盐水,20000r/min匀浆10s,间歇30s,反复进行3次,制成10%组织匀浆 (最好用超声波发生器处理30s),使线粒体振破,以中性红-詹钠氏绿B染液证明线粒体已振碎。以4000r/min离心5min,取上清液20μL待测。
样品测定 样品测定步骤见表4。
表4
试剂 | 测定管 | 对照管 |
1/15mol/L磷酸盐缓冲液pH7.8/ml 样品 | 1.0 A* | 1.0 |
10mmol/L盐酸羟胺/ml 7.5mmol/L黄嘌呤/ml 0.023U/ml黄嘌呤氧化酶/ml 双蒸水/ml | 0.1 0.1 0.1 0.5 | 0.1 0.1 0.1 0.5 |
混匀,37℃恒温水浴30min | ||
3.3g/L对氨基苯磺酸/ml 10g/L甲萘胺/ml | 2.0 2.0 | 2.0 2.0 |
混匀15min后,倒入1cm光径比色杯,以蒸馏水调零,530nm处比色测定OD值。 | ||
* A所用样品的量
红细胞抽提液 5～10μl
血清(或血浆) 20μl
组织匀浆 5～10μl
SOD标准抑制曲线 将SOD标准品用磷酸盐缓冲液配制成750U/ml的溶液,再稀释到50倍,即SOD量为15U/ml(1.5μg/ml),用本法测定不同量的SOD标准液的百分抑制率,以百分抑制率为纵坐标,以SOD活力单位U/ml为横坐标绘制标准曲线。
计算
每1ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个单位。
也可用酶比活法即以每管样品的百分抑制率从SOD标准曲线查出相应的SOD U/ml,乘以稀释倍数 (1ml取样量)。
若样品为组织匀浆液,根据匀浆浓度或组织蛋白质含量,将单位换算为U/g组织或U/mg蛋白。若样品为红细胞抽提液,根据血红蛋白含量,可换算为U/g Hb。
3.3.1.2.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据处理。受试物组与老龄对照组比较,SOD活力升高经统计差异有显著性 (P<0.05),判定该受试物有升高SOD作用,试验结果阳性。若受试物组SOD升高接近少龄对照组,两者统计差异无显著性 (P >0.05),则说明该受试物具有较强的升高SOD作用。
3.3.2 血(或组织)中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px) 活力测定
3.3.2.1 原理
谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统。对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要,其活力以催化GSH氧化的反应速度,及单位时间内GSH减少的量来表示。GSH和5,5’ -二硫对硝基苯甲酸(DTNB) 应在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子,于423nm波长有最大吸收峰。测定该离子浓度,即可计算出GSH减少的量。由于GSH能进行非酶反应氧化,所以最后计算酶活力时,必须扣除非酶反应所引起的GSH减少。
3.3.2.2 仪器和试剂
仪器 721分光光度计,低温高速离心机,匀浆器,恒温水浴锅,微量加样器。
试剂①叠氮钠磷酸缓冲液pH7.0
NaN3 16.25mg 终浓度2.5mmol/L
EDTA-Na2 7.44mg 终浓度0.2mmol/L Na2HPO4 1.732g终浓度0.2mol/L
NaH2PO4 1.076g 终浓度0.2mol/L
加蒸馏水至100ml,用少量HCl、NaOH调pH 7.0,4℃保存。
②1mmol/L谷胱甘肽 (还原型GSH) 溶液 GSH 30.7mg加叠氮钠磷酸缓冲液至100ml,临用前配制,冰冻保存1～2h。
③1.25 ～ 1.5mmol/L H2O2溶液取30%H2O20.15～0.17ml,用双蒸水稀释至100ml,作为贮备液,4℃避光保存,临用前将贮备液用双蒸水稀释10倍即可。
④偏磷酸沉淀液
HPO3 16.7g(先用蒸馏水溶解)
EDTA 0.5g
NaCl 280g
加蒸馏水至1000ml,用普通滤纸过滤,室温保存。
⑤0.32mol/L Na2HPO4溶液 Na2 HPO4 22.7g加蒸馏水至500ml,室温保存。
⑥DTNB显色液
DTNB 40mg
柠檬酸三钠 1.0g
加蒸馏水至100ml,4℃避光保存1个月。
3.3.2.3 实验步骤
3.3.2.3.1 样品制备
血样稀释液 取鼠血10μl加入到1ml双蒸水中,充分振摇,使之全部溶血1:100待测。4h内测定酶活力。若当天来不及测定,将肝素抗凝全血置-20℃冻存,3d内测定。若4℃存放,28h内必须测完。测前取出样品室温自然解冻,按1:100制备溶血液样品。
组织上清液 动物禁食过夜,处死后,立即取出所需脏器,放入冷生理盐水中洗去浮血,剔除脂肪及结缔组织,滤纸吸干后,在冰浴上剪成碎块,称取1.0g组织,加9ml冷生理盐水,以20000r/min匀浆10s,间歇30s,反复3次制成组织匀浆,操作在冰浴中进行,匀浆以12500×g离心10min(低温高速离心机),沉淀为破碎的细胞、细胞碎片、核及线粒体,上清液用以测胞液中的酶活力,最好当天测,否则加20%甘油分装于塑料管,放置-20～-80℃,可保存数周,而酶活力不减。
3.3.2.3.2 GSH标准曲线的制作
取1.0mmol/L GSH溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml,分别置于10ml小容器瓶中,各加入偏磷酸沉淀剂8ml,用双蒸水稀释至10ml刻度,即得到浓度为0、20、40、60、80、100μmol/L的GSH标准液。
取上述不同浓度标准液各2ml,放入试管中,加入0.32mol/L Na2HPO4 2.5ml,比色前加入DTNB显色液0.5ml,用光径1cm杯,5min内在可见光423nm波长测OD值。以双蒸水调零点。
以GSH含量 (μmol/L) 为横坐标,OD423值为纵坐标,绘制标准曲线。
3.3.2.3.3 测定步骤
测定步骤见表5。
表5
样品管/ml | 非酶管/ml | 空白管/ml | |
1.0mmol/L GSH 血样稀释液 | 0.4 0.4 | 0.4 | |
双蒸水* | 0.4 | ||
37℃水浴预温5min | |||
H2O2 (37℃预热) | 0.2 | ||
37℃水浴准确反应3min | |||
偏磷酸沉淀液 | 4 | 4 | |
3000r/min离心10min | |||
离心上清液 | 2 | 2 | |
双蒸水 | 0.4 | ||
偏磷酸沉淀液 | 1.6 | ||
0.32mol/L Na2HPO4 DTNB显色液 | 2.5 0.5 | 2.5 0.5 | 2.5 0.5 |
显色反应1min后于423nm波长 (1cm光径),读OD)值,5min之内读数准确 | |||
* 样品为组织上清液时,非酶管改为加热使酶失活的组织上清液。
3.3.2.3.4 计算
鼠全血GSH-Px活力单位 规定每毫升全血,每分钟,扣除非酶反应的log [GSH]降低后,使log [GSH] 降低1为一个酶活力单位。
组织GSH-Px比活力单位 规定每毫克蛋白质,每分钟,扣除非酶反应,使GSH浓度降低1μ mol/L为一个酶活力单位。
* Folin法或双缩脲法测样品蛋白质含量。
即标准曲线斜率。
3.3.2.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据处理。受试物组与老龄对照组比较,GSH-Px活力升高经统计差异有显著性(P<0.05),判定该受试物有升高GSH-Px作用,试验结果阳性。若受试物组GSH-Px升高接近少龄对照组,两者统计差异无显著性 (P>0.05),则说明该受试物具有较强的升高GSH-Px作用。
3.3.2.5 注意事项
3.3.2.5.1 由于H2O2易分解导致浓度改变,临用时取贮备液用分光光度计测其浓度。取贮备液3ml,测定1cm光径的240nm处OD值。
若OD值为0.45,则表明H2O2浓度为12.5mmol/L。
3.3.2.5.2 5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子的显色不仅与整个反应体系中氢离子浓度有关,还受反应时间限制。加入显色剂后,反应体系pH为6.5时,11min开始显色,此时比色5min内读数准确。
4 脑、肝组织中单胺氧化酶(MAO-B)活力测定
4.1 原理
人们发现哺乳动物中单胺氧化酶主要有2种形式,即MAO-A、MAO-B,其中MAOB活性随增龄上升,与衰老关系密切。人45～60岁之后,脑内MAO-B活性急骤升高,使去甲肾上腺素和多巴胺的调节功能降低,而加速衰老过程。另一方面,单胺类物质是在肝脏进行降解,因此延缓衰老的食品应对脑的MAO-B有显著的抑制作用,而对肝的MAO-B仅有轻微或没有抑制作用。
单胺氧化酶可催化各种单胺类化合物发生氧化脱氨反应,生成相应的醛、氨和过氧化氢。测定底物的消耗或产物的生成都可确定酶的活性。本方法以MAO-B的特异性底物盐酸苄胺为反应底物,测定其反应产物苄醛的生成量。利用苄醛在紫外部分λ=242nm处有一吸收高峰,测定酶作用反应后的光吸收值,推算出MAO-B的酶活性。
4.2 仪器和试剂
仪器 组织研磨器,超声波细胞破碎机,低温高速离心机,恒温水浴振荡器,紫外分光光度计,混旋器。
试剂 0.2mol/L磷酸盐缓冲液
A液 0.2mol/L Na2HPO4溶液
Na2HPO4·12H2O143.2g溶于2000ml双蒸水。
B液 0.2mol/L KH2PO4溶液
KH2PO4 13.6g溶于500ml双蒸水。
将A液1920ml、B液480ml混匀后,pH 7.4。
8mmol/L盐酸苄胺溶液
60%高氯酸
环己烷
4.3 实验步骤
4.3.1 粗酶液制备
取适量脑组织、肝组织,分别加入10倍体积预冷的0.2mol/L磷酸盐缓冲液 (pH7.4),置玻璃匀浆器内冰浴匀浆,超声24kHz,每次20s,间歇30s,共2次,于0℃以下1000×g离心10min,弃沉淀,上清液在4℃下17000×g离心30min,弃上清液,取其沉淀用0.2mol/L磷酸盐缓冲液重新悬浮,-20℃冰箱保存,不超过5d,最好当日测定。
4.3.2 测定步骤
测定步骤见表6。
表6
试剂 | 空白管/ml | 测定管/ml |
酶液 8mmol/L苄胺 | 0.5 0.3 | |
0.2mol/L磷酸盐缓冲液 | 3.0 | 2.5 |
37℃水浴振荡保温3h | ||
8mmol/L苄胺 | 0.3 | |
60%高氯酸 环己烷 | 0.3 4.0 | 0.3 4.0 |
加塞充分混合,3000r/min离心10min,取上清液在242nm处测OD值 | ||
为消除酶液中存在的单胺底物干扰,空白管在保温后,再加苄胺,采用Folin酚法测定酶液蛋白含量,以小牛血清白蛋白为标准蛋白。
4.3.3 计算
酶活性定义为 3h产生0.01个光吸收值改变的酶量为一个酶活性单位 (U),该光吸收值的改变相当于在37℃下生成1nmol/L的苄醛。
酶比活性单位表示为 ΔOD/mg蛋白·h,其中ΔOD为测定样品光吸收值与空白管光吸收值之差。
4.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据处理。受试物组与老龄对照组比较,脑MAO-B活力降低经统计差异有显著性(P<0.05),肝MAO-B活力不降低或微降,可判定该受试物有降低脑MAO-B作用,试验结果阳性。若受试物组脑MAO-B降低接近少龄对照组,两者统计差异无显著性 (P>0.05),则说明该受试物具有较强的降低脑MAO-B作用。
4.5 注意事项
4.5.1 酶液制备的全过程均应严格遵守低温操作原则。
4.5.2 操作程序中的振荡、混合一定要充分有效。
4.5.3 玻璃器皿最好用10%硝酸浸泡几小时,用蒸馏水反复冲洗,烘干备用。
4.5.4 蛋白测定用比色杯要用无水乙醇冲洗,滤纸吸干。
[附1] Folin酚法测定蛋白含量
1 原理
蛋白质在碱性条件下与铜形成复合物,然后又与钨酸钠-钼酸钠化合物产生蓝色反应,在750nm有最大吸收。若蛋白质含量超过25μg/ml时,应在500nm测定。本法灵敏,可测出0.2μg/ml蛋白质。
2 仪器和试剂
仪器 721型分光光度计,恒温水浴,试管,吸量管 (2ml、5ml)。
试剂
试剂甲 使用前将4%Na2CO3和0.2mol/L NaOH等体积混合,1% CuSO4·5H2O和2%酒石酸钾钠等体积混合。然后将它们50:1混合。只能当天使用。
试剂乙 (Folin酚试剂)在2L的磨口回流装置内加入100g钨酸钠(Na2WO4·H2O)、25g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、700ml蒸馏水,再加50ml 85%磷酸及100ml浓盐酸,充分混合后,以小火回流10h。再加入150g硫酸锂(LiSO4)、50ml蒸馏水及溴液数滴。然后开口继续沸腾15min,以便驱除过量的溴。冷却后定容到1L,过滤,滤液微呈绿色,于棕色试剂瓶中冰箱保存。使用时用标准氢氧化钠溶液滴定,酚酞为指示剂。而后适当稀释 (约1倍),使最终浓度为1mol/L。贮存于冰箱可长期保存。
蛋白质标准液 (预先用定氮法确定蛋白质纯度): 牛血清白蛋白 (电泳纯) 配成250μg/ml的水溶液。
3 实验步骤
3.1 绘制标准曲线
按0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml往各试管加入蛋白标准液,加双蒸水至1ml。各管加入试剂甲5ml混匀,30℃保温10min,加试剂乙0.5ml,快速混匀,30℃保温30min,于500nm测OD值。每种蛋白标准液浓度测2管,取平均值。以蛋白质浓度为横坐标,OD值为纵坐标,绘制标准曲线。
3.2 样品定量测定
样品定量测定步骤见表7。
表7
试剂 | 样品管/ml* | 对照/ml |
0.1 | ||
0.9 5.0 | 1.0 5.0 | |
30℃保温10min | ||
试剂乙 | 0.5 | 0.5 |
快速混匀,30℃保温30min,于500nm测OD值 | ||
* 样品管应作复管,取平均值。
3.3 计算
3.3.1 查标准曲线,求得蛋白质浓度(μg/ml),可测定范围是25～250μg/ml蛋白质。
3.3.2 标准液标准值对比:
式中 E0——对照液的OD值
Ex——待测液的OD值
Est——标准液的OD值
Cst——标准液的蛋白含量
V——稀释倍数
[附2] 双缩脲法测定蛋白质含量(按试剂盒要求操作)
(二) 人体试食试验
1 人群的选择
选45岁以上这一年龄段人群,排除经常服药、嗜酒、嗜烟者,以及有脑、心、肝、肺、肾、血液病等器质性疾病所致功能障碍者。随机分为1个对照组和1个剂量组,每组30人 (采用同龄对照加自身对照),按厂家推荐量给予受试物1～3个月。
2 实验方法
2.1 血清中过氧化脂质降解产物丙二醛 (MDA) 含量测定
2.1.1 原理
MDA (malondiadehycle) 是细胞膜脂质过氧化的终产物之一,测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。1个丙二醛 (MDA) 分子与2个硫代巴比妥酸 (TBA) 分子在酸性条件下共热,形成粉红色复合物。以波长515nm为激发光,在553nm有最强荧光强度。可用荧光法进行微量测定。
2.1.2 仪器和试剂
仪器 荧光分光光度计,微量加样器,恒温水浴锅,普通离心机,混旋器,具塞离心管。
试剂①6.7g/L硫代巴比妥酸 (TBA) -冰醋酸 (1:1) 混合液
②10mmol/L四乙氧基丙烷 (贮备液,4℃保存3个月),临用前用甲醇稀释成10nmol/ml
③1/6mol/L硫酸
④100g/L磷钨酸
⑤正丁醇
⑥无水乙醇
以上所用玻璃器皿均需经50%硝酸浸泡24h后,再经蒸馏水、双蒸水淋洗干燥。试剂 (选AR级) 最好用双蒸水配制。
2.1.3 实验步骤
2.1.3.1 样品制备
全血样品 取血50μl加入1ml生理盐水,2000r/min离心10min,取上清液待测。
血清样品 取血0.5ml室温静置10min,2000r/min离心10min,取上清液待测。
2.1.3.2 标准曲线制作
将10nmol/ml四乙氧基丙烷,用双蒸水稀释成0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、5nmol/ml,分别取1ml加入TBA-冰醋酸(1:1)混合液1ml→混匀,沸水浴75min→流水冷却至室温→5ml正丁醇振荡抽提2min→3000r/min离心10min→取上清液 (正丁醇层) 测荧光强度 (狭缝10nm,波长: 激发光515nm,发射光553nm),以四乙氧基丙烷浓度为横坐标,荧光强度为纵坐标作图。
2.1.3.3 样品测定
血清20μl(或全血上清液0.5ml) →加1/6mol/L硫酸4ml、100g/L磷钨酸0.5ml摇匀,室温放置5min→3000r/min离心10min,弃上清液→沉淀加1/6mol/L硫酸2ml,100g/L磷钨酸0.3ml摇匀,室温放置5min→3000r/min离心10min,弃上清液→沉淀用1ml蒸馏水振摇2min,再加TBA-冰醋酸 (1:1) 混合液1ml摇匀→95～100℃水浴75min(勿动!)→准时取出,流水冷却至室温→正丁醇5ml振荡抽提2min→3000r/min离心10min→取上清液 (正丁醇层)4ml测定荧光强度 (若出现混浊,可加1滴无水乙醇)。波长: 激发光515nm,发射光553nm,狭缝10nm,四乙氧基丙烷0.5nmol/ml为标准对照。
2.1.3.4 计算
测得荧光强度在标准曲线上可查得相应的MDA含量,然后换算成每1ml血清 (血液) 中的过氧化脂质的含量。
公式:
式中F——0.5 nmol/ml四乙氧基丙烷荧光度
f——样品荧光度
2.2 血中超氧化物歧化酶 (SOD) 活力及含量测定
可任选下列方法之一。
2.2.1 化学发光法
2.2.1.1 原理
黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化底物黄嘌呤或次黄嘌呤氧化生成尿酸的同时产生O2·-,O2·-与化学发光剂鲁米诺(氨基苯二酰肼)反应生成激发态的中间物,当中间物返回基态时,以光辐射的能量产生发光现象,由于SOD能清除O2·-,所以抑制鲁米诺的化学发光,其抑制程度与酶活力大小有关。
2.2.1.2 仪器和试剂
仪器 生物化学发光仪,微量加样器。
试剂①0.05mol/L碳酸盐缓冲液 (含1×10-4mol/L EDTA) pH 10.2
Na2CO3 3.68g Na2HCO3 1.28g EDTA 37.22mg
加双蒸水至1000ml,4℃储存1～2月。
②0.05mol/L磷酸盐缓冲液 (含1×10-4mol/L EDTA) pH 7.8
K2HPO4 7.970g KH2PO4 0.579g EDTA 37.22mg
加双蒸水至1000ml,室温放置1周。
③1×10-4 mol/L黄嘌呤 (xanthine) 黄嘌呤3.8mg加0.05mol/L碳酸盐缓冲液 (pH10.2)至250ml,新鲜配制。
④1×10-4 mol/L鲁米诺 (Luminol) 鲁米诺4.45mg加0.05mol/L碳酸盐缓冲液 (pH10.2)至250ml,新鲜配制。
⑤黄嘌呤-鲁米诺混合液 (1:1) 用前新鲜配制。
⑥黄嘌呤氧化酶* (0.1mg/ml) 黄嘌呤氧化酶 (46mg/ml) 22μl加入0.05mol/L磷酸盐缓冲液 (pH 7.8) 10ml,用前新鲜配制。
* 黄嘌呤氧化酶也可根据酶活性大小配成适当浓度,以在发光仪上空白产生300～400mv的读数为宜。
超氧化物歧化酶标准品
2.2.1.3 实验步骤
SOD标准曲线制作 将标准品SOD用0.05mol/L磷酸盐缓冲液 (pH 7.8) 稀释成2、4、6、8、10ng/ml,取不同浓度SOD液10μl,加黄嘌呤氧化酶10μl,再加鲁米诺-黄嘌呤混合液980μl,测反应1min后6s的发光值 (mV)。空白对照用0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.8) 10μl代替,以空白对照的发光强度为100%。抑制发光程度为纵坐标,SOD浓度为横坐标,绘制曲线,求出抑制50%发光程度时SOD的浓度C50(ng/ml)。
样品测定 取血10μl加入到0.5ml双蒸水中,充分振摇使之溶血 (1:50),待测。
表8
试剂 | 样品管 | 空白管 |
溶血液μl | ||
0.05ml/L磷酸盐缓冲液/μl | 10 | |
黄嘌呤氧化酶/μl 鲁米诺-黄嘌呤混合液/μl | 10 980 | 10 980 |
按表8顺序加样,混匀后立即计时,测1min后6s的发光值 (mV) 或积分值。
计算
在25℃条件下,抑制50%发光程度时所需的SOD的浓度C50 (ng/ml)为1个活力单位。
根据发光抑制率在标准曲线上查出样品的SOD含量(ng/ml)
2.2.1.4 注意事项
溶血液及黄嘌呤氧化酶的加样量可根据酶活性大小调整,但每次试验各组加样量要一致,最终反应体积为1ml,可在加混合液前用蒸馏水补齐。
SOD活力测定方法灵敏度的高低取决于pH和O2·-稳态浓度 (即黄嘌呤氧化酶的量)。
2.2.2 羟胺法
2.2.2.1 原理
O2·-氧化羟基的最终产物为亚硝酸盐,后者在对氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈现紫红色,在波长530nm处有极大吸收峰,可用发光光度法进行测定,当SOD消除O2·-后形成的亚硝酸盐减少。
2.2.2.2 仪器和试剂
仪器 721分光光度计,离心机,恒温水浴。
试剂①1/15mol/L磷酸盐缓冲液pH 7.8
②10mmol/L盐酸羟胺 盐酸羟胺6.95mg,加水至10ml。
③7.5mmol/L黄嘌呤 黄嘌呤11.41mg,加水至10ml。
④0.023U/ml黄嘌呤氧化酶 25U/0.9ml黄嘌呤氧化酶8.4μl,加pH 7.8磷酸盐缓冲液至10ml。
⑤10g/L甲萘胺
⑥3.3g/L对氨基苯磺酸
⑦SOD标准品
⑧三氯甲烷
⑨95%乙醇
2.2.2.3 实验步骤
红细胞抽提液制备 50μl全血冲入0.5ml生理盐水,2000r/min离心3min,弃上清液,加冰冷的双蒸水0.2ml混匀,加入95%乙醇0.1ml,振荡30s,加入三氯甲烷0.1ml,置快速混合器抽提1min,4000r/min离心3min,分层,上层为SOD抽提液,中层为血红蛋白沉淀物,下层为三氯甲烷,记录上清液体积待测。
样品测定 样品测定步骤见表9。
表9
试剂 | 测定管/ml | 对照管/ml |
1/15mol/L磷酸盐缓冲液pH7.8 样品 | 1.0 A* | 1.0 |
10mmol/L盐酸羟胺 7.5mmol/L黄嘌呤 0.023U/ml黄嘌呤氧化酶 双蒸水 | 0.1 0.1 0.1 0.5 | 0.1 0.1 0.1 0.5 |
混匀,37℃恒温水浴30min | ||
3.3g/L对氨基苯磺酸 10g/L甲萘胺 | 2.0 2.0 | 2.0 2.0 |
混匀15min后,倒入1cm光径比色杯,以蒸馏水调零,530nm处比色测定OD值 | ||
* A所用样品的量
红细胞抽提液 5～10μl
血清(或血浆) 20μl
SOD标准抑制曲线 将SOD标准品用磷酸盐缓冲液配制成750U/ml的溶液,再稀释到50倍,即SOD量为15U/ml(1.5μg/ml),用本法测定不同量的SOD标准液的百分抑制率,以百分抑制率为纵坐标,以SOD活力单位U/ml为横坐标绘制标准曲线。
计算
每1ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个单位。
也可用酶比活法即以每管样品的百分抑制率从SOD标准曲线查出相应的SOD U/ml,乘以稀释倍数 (1ml/取样量)。
样品为红细胞抽提液,根据血红蛋白含量,可换算为U/gHb。
2.3 血中谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 活力测定
2.3.1 原理
谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统。对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要,其活力以催化GSH氧化的反应速度,及单位时间内GSH减少的量来表示。GSH和5,5'-二硫对硝基苯甲酸(DTNB) 反应在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子,于423nm波长有最大吸收峰,测定该离子浓度,即可计算出GSH减少的量。由于GSH能进行非酶反应氧化,所以最后计算酶活力时,必须扣除非酶反应所引起的GSH减少。
2.3.2 仪器和试剂
仪器 721分光光度计,恒温水浴锅,微量加样器,离心机。
试剂①叠氮钠磷酸缓冲液pH7.0
NaN3 16.25mg 终浓度2.5mmol/L
EDTA-Na2 7.44mg 终浓度0.2mmol/L
Na2HPO4 1.732g 终浓度0.2mol/L
NaH2PO4 1.076g 终浓度0.2mol/L
加蒸馏水至100ml,用少量HCl、NaOH调pH 7.0,4℃保存。
②1mmol/L谷胱甘肽 (还原型GSH) 溶液 GSH 30.7mg加叠氮钠磷酸缓冲液至100ml,临用前配制,冰冻保存1～2d。
1.25～1.5mmol/LH2O2溶液 取30%H2O2 0.15～0.17ml,用双蒸水稀释至100ml,作为贮备液,4℃避光保存,临用前将贮备液用双蒸水稀释10倍即可。
偏磷酸沉淀液
HPO3 16.7g(先用蒸馏水溶解)
EDTA 0.5g
NaCl 280g
加蒸馏水至1000ml,用普通滤纸过滤,室温保存。
0.32mol/L Na2HPO4溶液 Na2HPO422.7g加蒸馏水至500ml,室温保存。
DTNB显色液
DTNB 40mg
柠檬酸三钠 1.0g
加蒸馏水至100ml,4℃避光保存1个月。
2.3.3 实验步骤
2.3.3.1 样品制备
血样稀释液 取血20μl加入到1ml双蒸水中,充分振摇,使之全部溶血1:100待测,4h内测定酶活力。若当天来不及测定,将肝素抗凝全血置-20℃冻存,3d内测定;若4℃存放,28h内必须测完。测前取出样品室温自然解冻,按1:100制备溶血液样品。
2.3.3.2 GSH标准曲线的制作
取1.0mmol/L GSH溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml,分别置于10ml小容器瓶中,各加入偏磷酸沉淀剂8ml,用双蒸水稀释至10ml刻度,即得到浓度为0、20、40、60、80、100μmol/L的GSH标准液。
取上述不同浓度标准液各2ml,放入试管中,加入0.32mol/L Na2HPO4 2.5ml,比色前加入DTNB显色液0.5ml,用光径1cm杯,5min内在可见光423nm波长测OD值。以双蒸水调零点。
以GSH含量(μmol/L)为横坐标,OD423值为纵坐标,绘制标准曲线。
2.3.3.3 测定步骤
测定步骤见表10。
表10
试剂 | 样品管/ml | 非酶管/ml |
1.0mmol/L GSH 血样稀释液 | 0.4 0.4 | 0.4 |
双蒸水* | 0.4 | |
37℃水浴预温5min | ||
H2O2(37℃预热) | 0.2 | 0.2 |
37℃水浴准确反应5min | ||
偏磷酸沉淀液 | 4 | 4 |
3000r/min离心10min | ||
离心上清液 双蒸水 偏磷酸沉淀液 | 2 | 2 |
0.32mol/L Na2HPO4 DTNB显色液 | 2.5 0.5 | 2.5 0.5 |
显色反应1min后于423nm波长 (1cm光径),读OD值,5min之内读数准确 | ||
2.3.3.4 计算
全血GSH-Px活力单位 规定每8μl全血,在37℃反应5min,扣除非酶反应后,使GSH浓度降低1μmol/L浓度为一个酶活力单位。
全血GSH-Px活力U/ml血=(非酶管OD-样品管OD) ×A*×5**
* ,即标准曲线的斜率
**5换算成1ml反应液中GSH浓度时,需乘以稀释倍数5
2.3.3.5 注意事项
2.3.3.5.1 由于H2O2易分解导致浓度改变,临用时取贮备液用分光光度计测其浓度。取贮备液3ml,测定1cm光径240nm处OD值。
若OD值为0.45,则表明H2O2浓度为12.5mmol/L。
2.3.3.5.2 5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子的显色不仅与整个反应体系中氢离子浓度有关,还受反应时间限制。加入显色剂后,反应体系pH为6.5时,11min开始显色,此时比色5min内读数准确。
2.4 数据处理与结果判定
一般采用方差分析进行数据处理。受试物组过氧化脂质含量降低,超氧化物歧化酶或谷胱甘肽过氧化物酶活性升高,与对照组比较,经统计差异有显著性 (P <0.05),判定该受试物有抗氧化作用。
三、改善记忆作用检验方法
(一) 动物试验
1 跳台实验
1.1 原理
反应箱底铺有通36V电压的铜栅,动物受到电击,其正常反应是跳上箱内绝缘的平台以避免伤害性刺激。多数动物可能再次或多次跳至铜栅上,受到电击又迅速跳回平台,如此训练5min,并记录每鼠受到电击的次数或叫错误次数,以此作为学习成绩。24h或48h重作测验,此即记忆保持测验。记录受电击的动物数、第一次跳下平台的潜伏期和3min内的错误总数。
1.2 仪器和试剂
跳台仪 该装置为 (10×10×60) cm3的被动回避条件反射箱,用黑色塑料板分隔成5间。底面铺以铜栅,间距为0.5cm,可以通电,电压强度由一变压器控制。每间左后角置一高和直径均为4.5cm的绝缘平台。
试剂 樟柳碱,环己酰亚胺,乙醇。
1.3 实验方法
1.3.1 实验动物 断乳鼠,体重10g左右; 或成年鼠,体重18～22g。雌雄均可,单一性别不少于10只,推荐使用近交系小鼠。
1.3.2 剂量设置、给样途径及期限
设高、中、低、对照四个组,根据推荐的人体每日每公斤体重摄入量,扩大10倍作为其中一个剂量组,根据受试物的具体情况另设两个剂量组。经口给样。原则上连续给样30d,也可根据试验需要自行设定给样期限。
1.3.3 实验步骤
1.3.3.1 模型制造
记忆获得障碍模型制造: 训练前10min腹腔注射樟柳碱或东莨菪碱5mg/kg体重;
记忆巩固障碍模型制造: 训练前10min腹腔注射环己酰亚胺120mg/kg体重;
记忆再现障碍模型制造: 重测验前30min灌胃30%的乙醇0.1ml/10g体重。
1.3.3.2 受试物对正常小鼠记忆的影响
连续给样30d,对照组给自来水。末次给样后次日 (或一次给样后1h) 开始训练。将动物放入反应箱内适应环境3min,然后立即通以36V的交流电。动物受到电击,其正常反应是跳回平台,以躲避伤害性刺激。多数动物可能再次或多次跳至铜栅上,受到电击又迅速跳回平台上,如此训练5～8min 同一试验中所有小鼠训练时间相同),记录后5min的错误次数,以此作为学习成绩。24或48h后重作测验,此即记忆保持测验。记录受电击的动物数、第一次跳下平台的潜伏期和3min内的错误总数,同时计算动物出现错误反应的频率。
1.3.3.3 受试物对记忆障碍模型小鼠的影响
记忆障碍模型小鼠制造方法同1.3.3.1,操作方法同1.3.3.2。
1.4 数据处理及结果判定
潜伏期结果为计量资料,可用方差分析。若受试物组与对照组比较,潜伏期明显缩短,差异有显著性(P<0.05),重复测验结果一致,可判定为该项实验指标阳性。错误次数为记数资料,若受试物组错误次数明显少于对照组,差异有显著性 (P<0.05),且重复测验结果一致,可判定为该项实验指标阳性。
1.5 注意事项
1.5.1 动物在24h内有其活动周期,不同时相处于不同的觉醒水平,故每次实验应选择同一时间 (上午8～12点或下午1～5点),前后2d的实验要在同一时间内完成。
1.5.2 实验应在隔音、光强度和温、湿度适宜且保持一致的行为实验室进行。
1.5.3 动物的回避性反应差异较大,可对动物进行预选,剔除不合格者。
1.5.4 最好采用纯系动物,试验前数天将动物移至实验室以适应周围环境。
1.5.5 实验者必须每天与动物接触,如喂水、喂食和抚摸动物。
1.5.6 减少非特异性干扰,如情绪、注意、动机、觉醒、运动活动水平、应激和内分泌等因素。
1.5.7 受试物作用的多重性。有的作用易化记忆过程,而有的作用阻抑记忆过程;或在给样后不同时间分别产生不同的作用,以至在某一时间内出现记忆改善,而在随后的某一时间内记忆减弱。
1.5.8 考虑动物种属差异。
2 避暗法
2.1 原理
利用小鼠嗜暗的习性设计一个装置,一半是暗室,一半是明室,中间有一小洞相连。暗室底部铺有通电的铜栅,并与一计时器相连,计时器可自动记录潜伏期的时间。小鼠进入暗室即受到电击,计时自动停止。
2.2 仪器和试剂
避暗仪 该装置分明暗两室。明室大小为11cm×3.2cm,其上方约20cm处悬一40W钨灯丝。暗室较大,大小为17cm×3.2cm,两室之间有一直径约3cm的圆洞。两室底部均铺以铜栅。暗室底部中间位置的铜栅可以通电,电击强度可在一旋钮上任意选择。一般采用40V电压。暗室与一计时器相连,计时器可自动记录潜伏期的时间。
试剂 樟柳碱,环己酰亚胺,乙醇。
2.3 实验方法
2.3.1 实验动物
同跳台试验。
2.3.2 剂量设置、给样途径及期限
同跳台试验。
2.3.3 实验步骤
2.3.3.1 受试物对正常小鼠记忆的影响
受试物组连续给样30d,对照组给自来水,末次给样后次日 (或一次给样后1h) 开始训练。实验时将小鼠面部背向洞口放入明室,同时启动计时器。动物穿过洞口进入暗室受到电击,计时器自动停止,取出小鼠,记录每鼠从放入明室至进入暗室遭电击所需的时间,此即潜伏期。24h或48h后重作测验,记录每只动物进入暗室的潜伏期和5min内的电击次数,同时记录5min内进入暗室 (错误反应) 的动物百分率。
2.3.3.2 受试物对记忆障碍模型小鼠的影响
模型制造方法同跳台试验,操作方法同2.3.3.1。
2.4 数据处理及结果判定
潜伏期时间为计量资料,可用方差分析。5min内进入暗室的动物数为计数资料,可用x2检验。若受试物组小鼠的潜伏期和/或5min内进入暗室的动物数明显短于和/或少于对照组,且差异有显著性(P<0.05),可判定为该项实验阳性。
2.5 注意事项
同跳台试验。
3 穿梭箱试验(双向回避试验)
3.1 原理
条件反射。
3.2 仪器和试剂
大鼠穿梭箱 该装置由实验箱和自动记录打印装置组成。实验箱大小为50cm×16cm×18cm。箱底部格栅为可以通电的不锈钢棒,箱底中央部有一高1.2cm挡板,将箱底部分隔成左右两侧。实验箱顶部有光源和蜂鸣音控制器,自动记录打印装置可连续自动记录动物对电刺激 (灯光或/和蜂鸣器) 的反应和潜伏期,并将结果打印出来。
试剂 樟柳碱,环己酰亚胺,乙醇。
3.3 实验方法
3.3.1 实验动物
Wistar或SD大鼠,断乳鼠或成年鼠,雄、雌均可。
3.3.2 剂量设置、给样途径及期限
同跳台试验。
3.3.3 实验方法
3.3.3.1 受试物对正常大鼠条件反射建立的影响
将大鼠放入箱内任何一侧,20s后开始呈现灯光或蜂鸣音,持续20s,后10s内同时给以电刺激(100V,0.2mA,50Hz,AC)。大鼠在遭电击后即逃避,必须跑到对侧顶端,挡住光电管后才可中断电击,此为被动回避反应。在每次电击前给予条件刺激,反复强化后,大鼠在接受条件刺激后即跳向对侧并挡住光电管而逃避电击,此为主动回避反应,隔天训练一回,每回50次,连续训练4～5回后,动物的主动回避反应率可达80%～90%以上。根据打印结果分析如下指标,动物反应次数,动物主动回避时间,动物被动回避时间,动物主动回避率。停止训练5～50d内,分2～3次测定其记忆消退情况。
3.3.3.2 受试物对记忆障碍模型大鼠条件反射建立的影响
模型制造同跳台试验,操作方法同3.3.3.1。
3.4 数据处理及结果判定
动物主动回避时间和被动回避时间为计量资料,可用方差分析。若试验组主动和/或被动回避时间明显短于对照组,差异有显著性 (P<0.05),可判定为该实验阳性。
3.5 注意事项
同跳台试验。
4 水迷宫试验
4.1 原理
动物都有一种 “探索” 和 “更替”倾向,当离开一个臂时,总是跑向 “久” 未跑过的 “新”臂,小鼠不愿在水中,因而寻找能爬出水面的阶梯,训练后,小鼠能记住找到阶梯的路线。
4.2 仪器与试剂
水迷宫自动记录仪。该仪器是由迷宫游泳箱和自动记录仪两部分组成。迷宫游泳箱由聚乙烯塑料制成,长100cm,宽100cm,高30cm; 内径长90cm,宽90cm,高30cm,泳道宽12cm,泳道走向固定。见图1。
图1
4.3 实验方法
4.3.1 实验动物
推荐使用纯种小鼠,断乳鼠或成年鼠,雌雄均可
4.3.2 剂量设置、给样途径和期限
均同跳台试验。
4.3.3 实验方法
4.3.3.1 受试物对正常小鼠记忆的影响
连续给样30d,末次给样次日开始训练。训练期间继续给样,每天1次。迷宫泳道水深15cm,水温 (25±1)℃。试验时,将小鼠放于泳道的起点 (S) 处,同时按下启动键,观察到达终点 (G) 所需时间,以及出现错误次数。将小鼠训练时间限定为120s,在120s内未到达终点的小鼠均记为120s。
第一次训练前将小鼠放在梯子附近,使其自动爬上3次。以后每次训练前将小鼠放在梯子附近,使其自动爬上1次。试验分阶段进行,视动物学习成绩逐步加长路程。第一次训练时用一挡板在A处开始训练。第二次训练加长路程,从B处开始,此路程约训练3次,共训练4次,至动物数80%以上到达终点,末次从起点进行训练。最后计算各组动物的错误次数,到达终点的时间及到达终点的动物数。一周后进行消退试验。
4.3.3.2 受试物对记忆障碍模型小鼠的影响
模型制造同跳台试验,操作方法同4.3.3.1。
4.4 数据处理及结果判定
到达终点的时间属计量资料,可用方差分析,错误次数和到达终点的动物数两指标为计数资料,可用x2检验。若其中1个或1个以上指标为阳性 (P<0.05),可判为该项试验阳性。
4.5 注意事项
4.5.1 训练时在目标区 (终点) 停留的时间不能太短,否则失去强化效果。
4.5.2 每天训练结束后,要对实验箱进行清洗,以清除动物留下的气味。
4.5.3 实验前可对动物进行初筛,经训练后,3min内仍不能游至终点者淘汰。
4.5.4 其余同跳台试验。
记忆测试指标参见表11。
表11 记忆测试指标一览表
测 试 项 目 | 评 价 指 标 | 所用仪器 | |
被 动 回 避 | 跳台试验 避暗试验 味觉厌恶试验 嗅觉厌恶试验 | 被动回避时间、错误次数和动物出现错误反应百分率 同上 回避时间、错误次数 动物在有特殊气味的环境中单位时间内 (150s)修饰时间和其在原 窝中单位时间内 (150s)修饰时间之比 | 跳台仪 避暗仪 |
主 动 回 避 | 单向回避试验 双向回避试验 Sidman回避试验 | 达标所需的训练次数 回避时间和回避率 回避时间和回避率 | 穿梭箱 穿梭箱 Sidman |
迷 宫 试 验 | Y型迷宫试验 T型迷宫试验 水迷宫试验 | 达标所需的训练次数 达标所需的训练次数 到达安全台的时间和达标所需的训练次数,动物出现错误反应的 百分率 | Y型迷宫 T型迷宫 水迷宫 |
操 作 式 条 件 反 射 试 验 | 连续强化程序 比率程序 间隔程序 低速差式强化程序 高频率差式强化程序 | 达标所需训练次数或单位训练时间内动物得到的强化次数 反应率 强化率 反应率 强化率 反应率 强化率 反应率 强化率 | Skinner |
注: 表中未提供检验方法的指标可参考有关文献进行。
(二) 人体试食试验
5 人体试食试验
5.1 原理
用经典的韦氏记忆量表和/或临床记忆量表评价受试者的记忆水平,可以反映受试物对受试者记忆能力的影响。
5.2 材料
5.2.1 录有指向记忆和联想学习的指导语和刺激词的磁带。
5.2.2 图片材料 (分甲、乙两套)
5.2.2.1 无意义图形再认
备第一次呈现用目标刺激图片20张,备第二次再认时呈现用目标刺激和混入刺激图片各20张,共40张,合计60张图片。
5.2.2.2 图像自由回忆物象图片
两组各15张,共30张。
5.2.2.3 人像特点联系回忆
备第一次呈现用的黑白勾画人面像6张,备回忆时呈现的人面像6张,两者内容相同,顺序不同,共计12张; 每张人像图片背面标有该人像的姓氏、职业、爱好、特点。
5.2.3 录音机,秒表,记录纸。
5.3 改善记忆的保健食品人体试食试验的一般原则。
5.3.1 受试物
进行人体试食试验,受试物必须有其来源、组成、加工工艺和卫生条件的详细说明,必须先经毒理学安全性评价,证明安全无毒,也不存在任何潜在的危险因素,经体外或动物体内功效试验已证明有效,在此基础上,才能进行人体试食试验。
5.3.2 受试者
参加人体试食试验的受试者应本着自觉自愿的原则。人群既可以是智力正常者,也可以是智力障碍者。受试物组和对照组必须是同一年龄层次的人。
5.3.3 研究人员
参加本试验的研究人员应以保障受试者的健康为前提,对受试者高度负责。
5.3.4 试验指标的选择
保健食品的作用是多方面的,试验时应选择有针对性、有代表性和敏感的指标。
5.4 实验方法
5.4.1 韦氏记忆量表
简称WMS。常用于记忆损伤测定。它包括常识、定向、心智、逻辑记忆、背数、视觉再生和联想记忆七个分量表。
韦氏记忆量表的评估方法,是将各项分量表记分综合,求出一个记忆商数 (MQ),以MQ来表示一个人的记忆水平。MQ的计算方法与韦氏智力量表基本上相同。分甲乙两式,各含7个分测验。它的优点是可以检测几种记忆,可用一个记忆商数表示记忆一般情况。
5.4.2 临床记忆量表
特点是备有有文化和无文化两个部分的正常值,便于文盲测验者应用。临床记忆量表共包括5个分量表。
5.4.2.1 指向记忆
包括两组内容,每组24个词,每词由2～3个字组成,以1s的速度读出,两个词之间间隔2s,其中有12个词属于同一类别,即为指向词; 另12个是混在其中相类似的词,为非指向词。例如甲套第一组词中有12个词属于水果类,混杂的词有粽子、年糕、冰糖等12个食品类词; 第二组词中有12个词属于动物类,混杂的词有皮肤、尾巴、眼睛、耳朵等身体器官类词12个。要求受试者记忆指定的同类别词 (如水果)。24个词随机排列,用录音机放送,每组词全部放送完毕后,要求受试者立即回忆,说出要求记忆的一类 (不一定要按放送的顺序回忆)。主试者按受试者回忆的顺序,将所说出的内容在记录纸上按顺序用数字记在相应词下面的方格内,并记录总的反应时间,如果受试者说出的不是放送的词内容 (称为 “添加性错误”),则写在记录纸上该组词后面空格内。如果说的是混杂进去的不需记忆的词,则记在下面非指向栏内相应词下,亦算错误。反应时间从主试者说: “现在请您回答” 算起,直到回忆结束。允许回忆时间不超过2min。
当第一组词受试者回忆结束后,间隔5s,再重复一遍指导语,然后放送第二组词,方法同前。在第二组词回忆完毕后,询问受试者 “除了要求您记的动物 (或穿戴) 这类词以外,您还记得别的词吗?” 这就是 “非指向记忆” 结果,可记录在表内混杂词下面的方格内。这里要注意在第一组词回忆完毕时,不要做这样的询问,否则将引起受试者在识记第二组词时把注意力指向包括指向和非指向在内的所有词,那就不符合这项测验的原意了。最后询问受试者 “用什么方法记忆”。
指导语: “我念一些词,您要注意听,里面有的是水果名字 (或动物名字、蔬菜名字、穿戴的东西),有的不是,要求您记住水果名字 (或动物名字——天上飞的、地下跑的、爬的、大的、小的都算; 蔬菜名字、穿戴的东西)。我念完以后,您要把听过的水果 (或动物、蔬菜、穿戴) 的名字说出来,不一定按照我念的顺序说,记得什么就先说什么,听明白了吗? 现在注意听”。如果指导语没听明白,可以重复口述一遍。口头重复时,指导语不得任意更改,例如,“要求记住水果 (或其他) 名字” 不得改成 “只要记住水果名字或光记 (或就记) 水果名字”,加上 “不记其他的东西” 就更不对了,这会导致不同的结果,是不允许的。
计分: 以两组指向记忆刺激词的正确回忆数之和来计分,并记录添加性错误的词或其他错误,备分析研究用 (满分24分)。
甲套指向记忆词呈现顺序为:
1 橘子 香蕉 粽子 石榴 桃子 粉条 年糕 西瓜 葡萄 冰糖 鸭蛋 柿子 茶叶 豆腐 苹果 白酒 牛奶 李子 饼干 杏 花椒 香瓜 木耳 鸭梨
2 乌鸦 公鸡 耳朵 蜜蜂 兔子 指甲 皮肤 狐狸 麻雀 眼睛 肩膀 青蛙 牙齿 肝脏 苍蝇 翅膀 心脏 老虎 头发 猴子 尾巴 蜻蜓 鼻子 蚂蚁
乙套指向记忆词呈现顺序为:
1 萝卜 茄子 大麦 韭菜 黄瓜 玉米 松树 扁豆 冬瓜 梅花 稻子 辣椒 荷花 杨树 白菜 桃花 棉花 菠菜 芝麻 西红柿 菊花 芹菜 柳树 豆芽菜
2 围巾 球鞋 牙膏 裙子 手套 筷子 板凳 短裤 雨衣 铁锅 剪刀 大衣 闹钟 电灯 袜子 火柴 缝纫机 皮袄 刷子 衬衫 扁担 毛裤 扫帚 草帽
5.4.2.2 联想学习
每套有12对2个字组成的词构成量表,其中容易的 (成对联想词间有逻辑联系)与困难的 (成对联想词间无逻辑联系) 成对词各6对。容易联想包括反义词 (如困难——容易)、同类词 (如太阳——月亮) 和从属词 (如牲口——牛马) 各两对; 困难联想包括具体——具体 (如西瓜——衣服)、抽象——具体 (如勇敢——电灯) 和抽象——抽象 (如光明——服从) 成对词各两对。用以检查对不同成对词的记忆情况。以每对词3s的速度读出,两对词之间间隔2s,12对词随机排列,用录音机放送,共放送3遍,即受试者有3次学习机会,但每遍词放送的顺序不同。每放送一遍后,主试者念每对词的前面一个词 (即刺激词),要求受试者答出后面一个词来 即反应词),主试者将结果记录在相应格内。如果回答正确,打 “√” 号,如果错误,则记录错答之词,没答出来,则以 “0” 表示。每对词允许回忆时间5s。最后询问受试者 “用什么方法记忆”。
指导语: “我给您念12对词,您要注意听,要求您记住哪两个词是连在一起的一对,比如我念 ‘桌子——马车’,表示 ‘桌子’ 和 ‘马车’ 是联在一起的一对词。我念完12对词以后,就念每对词中的前面一个词,要求您答出和它一对的后面一个词来,比如我念 ‘桌子’,您就回答 (停顿一下,让受试者回忆) ‘马车’,听明白了吗?” 如果没听明白,可以重复口述一遍。
计分: 分为容易、困难以及两者之和三种分数。每遍放送后对容易的词,每答对一个,计0.5分,6对共3分; 困难的词每答对一个计1分,6对共6分,6对容易和6对困难词之和为9分,三遍的满分为27分。
5.4.2.3 图像自由回忆
包括2组画有物体的图片材料,每组15张,所画的物体都是人们常见的、熟悉的和易于辨认的东西,如日用品、交通工具等。每张图片呈现4s、图片间间隔2s,图片顺序随机排列。15张图片呈现完毕后,要求受试者立即回忆说出所记得的图片内容(不一定要按刺激呈现的顺序回忆)。主试者按受试者回忆的顺序,将所记得的图片在记录纸上按顺序用数字记在相应图片名称下的方格内,并记录总的反应时间。如果受试者说出的是图片中没有的内容 (称为添加性错误),则写在记录纸上该图片系列后面的空格内。反应时从主试者说 “现在请您回答” 算起,直到回忆结束。允许回忆时间不超过2min。
当第一组图片受试者回忆结束后,间隔5s,再重复一遍指导语,然后呈现第二组图片,方法同前。最后询问受试者 “用什么方法记忆”。
指导语: “我给您看一些图片,您要仔细看,并记住它们是什么,有看不清的可以问,等全部看完后,立即说出您看到的是些什么东西,不一定按照我念的顺序说,记得什么就先说什么,听明白了吗? 现在注意看”。如果没听明白,可以重复口述一遍,直到受试者理解为止。
计分: 以两组图片的正确回忆数之和计分 (满分30分),并记录添加性错误。
5.4.2.4 无意义图形再认识
包括20张目标刺激图片,40张再认刺激图片 (其中与呈现图片相同目标刺激图片20张,相似混同刺激图片20张)。目标刺激为5种形式的无意义图形,即曲线封闭、直线封闭、曲线直线、曲线不封闭、直线不封闭。每种各4张,共20张。
测验时,先给受试者分别呈现20张目标刺激图片,每张呈现3s,相隔3s,要求受试者记住这些目标刺激。然后,随机呈现40张再认刺激图片 (包括目标刺激图片和混同刺激图片),图片随机排列,要求受试者将与目标刺激图片完全相同的图片辨认出来,即每张图片呈现时回答 “看过” 或 “没看过”,每张允许回忆时间为5s。如果对目标刺激回答“看过”,则按图片中央Z号(从1～20) 在记录纸目标刺激一项相应格内打“√” 号,如答 “没看过”,则打“×” 号。如果对混入刺激回答 “没看过”,则按图片中央Z号 (从21～40) 在记录纸混入刺激一项相应格内打 “√” 号,如答 “没看过”,则打 “×” 号。最后询问受试者 “用什么方法记忆”。
无意义图形背面的数字表示
指导语: “我给您看一些由简单的曲线和直线构成的图形,看的时间比较短,您要仔细看,并记住它们的特点,有看不清的可以问,等看完后,我再给您看另一些图片,其中有您看过的,也有您没看过的,它们都很相似,要求您认出哪些是看过的,哪些是没看过的,听明白了吗? 现在注意看”。如果没听明白,可以重复口述一遍,直到受试者理解为止。
计分: 再认分= (正确再认目标刺激-错误混入刺激数) ×2 (满分40分),
即再认分= (击中-虚报) ×2
对目标刺激回答 “看过”,称为 “击中”,对没看过的混入刺激也回答 “看过”,称为 “虚报”。
5.4.2.5 人像特点联系回忆
包括6张黑白人面像图片。按随机顺序排列每张人像分别呈现9s,间隔3s,在呈现的同时,告诉被测验者每张图片上的人像的姓名、职业和爱好等特点,重复2遍,并要求被测验者记住人像及特点之间的联系。然后再以另一顺序呈现这些图片,让被测验者立即说出人像的姓名、职业和爱好等特点。如果回答正确,主试者在记录纸相应格内打“√” 号,回答错误,则记下说错的内容,每张人像允许回忆时间30s。
指导语: “我给您看一些画的人像,在给您看每张人像的同时,向您介绍他的姓名、职业和爱好特点,请您一边注意看人像,一边注意听介绍,且要把人像和他的三个特点联系起来记忆。看完全部人像后,当我再给您看每一张人像时,要求您立即说出他的三个特点,不一定按我说的顺序回答,记得什么先说什么,听明白了吗?” 如果没听明白,可以重复口述一遍,直到受试者理解为止。
计分: 分别记录回忆出的姓名、职业和爱好的数目,每个姓名记2分,每项职业和爱好记1分,然后以三项总和计分 (满分24分)。
临床记忆量表的5个分量表都有各自的记分方法,各分量表得出的分数均为原始分。根据这些原始分,换算量表分的等价值表,查出各分量表的量表分,计算出总量表分。然后按照不同的年龄组的总量表分的等值记忆商数换算表,即可查得记忆商数(MQ)。这就作为衡量人的记忆水平的指标。
5.5 数据处理及结果判定
计量资料一般用方差分析,计数资料用X2检验。受试物组与对照组比较,差异有显著性 (P <0.05),说明该受试物可增强人体记忆能力。
5.6 注意事项
5.6.1 心理测验必须由受过训练的人员进行,否则影响试验结果。
5.6.2 主试者应当在一个安静的房间内进行。应尽量避免有第三者在场。在特殊情况下有第三者在场时,则必须叮嘱他不要做可能干扰受试的事。
5.6.3 本量表内有三项和视觉有关的分测验,室内光线必须保证能看得清楚刺激图片。主试者受试者相对而坐,在呈现图片刺激时,图片一般距离受试眼睛30cm左右,对老人则要求戴上眼镜测试,总之,以受试者对刺激看得清楚为原则。要了解受试者的听力和视力情况,尽量排除因听力或视力不佳而影响记忆成绩。
5.6.4 必须注意受试者受测时的精神状态,测验需在受试者情绪正常 (病人例外)、不反对接受测试、注意力比较集中的情况下进行。受试者是否疲倦,注意力是否集中,是否配合,对测试是否紧张,是否有信心等,均需记录在记录纸的首页上。如受试者是病人则需注明其疾病诊断及当时的病理状态,如是否有妄想性病理思维或颅压增高头痛等。
5.6.5 施测顺序一般是先听觉测验后视觉测验。具体测验顺序是: (1) 指向记忆,(2) 联想学习,(3) 无意义图形再认,(4) 图像自由回忆,(5) 人像特点联系回忆。要求一次做完。在测试病人时有时因为病人状态不佳而不得不分两次进行时,两次测验时间应尽量接近,间隔不得超过3d。在用年龄量表分比较分测验成绩时,必须注意不同分测验是否在相同的精神状态下进行的。
5.6.6 填写记录必须认真,字迹清楚。填写时注意以下几点:
5.6.6.1 首页必须逐项填写,即受试者的姓名、性别和年龄,以及检查日期。
5.6.6.2 填写文化程度和职业作为了解受试者接受测验的背景材料。
5.6.6.3 填写健康状况或诊断,前一夜睡眠情况或当时疲倦与否。
5.6.6.4 对表明当时精神状况的各项,如配合程度、注意力、紧张状态、信心等也要填写清楚。
5.6.6.5 除记录受试者记忆回答的正误外,应当记下错误回答的具体内容,以备分析研究用。
5.6.6.6 要记录反应时间但不做记分用。用于对反应过慢或过快的受试者进行研究。
5.6.6.7 是否应用记忆方法以及使用什么方法对记忆研究是有益的。在用此量表进行研究时应当记录此项。
5.6.6.8 各项分测验成绩的原始分记入首页总结表中,要先经复查,复查无误方可填入原始分项内。
四、促进生长发育作用检验方法
1 原理
行为畸胎学实验方法可较灵敏和全面地反映外界因素对幼小机体体格及神经发育的影响,我们可以利用其中的某些指标,如胎仔出生情况、成熟、生长和生长速率、先天性反射行为、性发育、学习能力等来探讨在母体孕期、哺乳或仔体断乳至成年期给予受试物对动物生长发育的影响。
2 仪器
平面翻正台,抓杆仪,悬崖回避台,嗅觉定向台,听觉惊吓反应室。
3 实验方法
3.1 实验动物
孕鼠,选2月龄的小鼠,以雌、雄2:1的比率合笼交配,查到阴栓者为受孕鼠,备用。
3.2 剂量设置、给样途径及期限
设高、中、低、对照四个组,根据推荐的每日每公斤人体摄入量,扩大10倍作为其中一个剂量组,根据受试物的具体情况另设2个剂量组。经口给样。母鼠从受孕到仔鼠断乳 (21d) 连续给样,仔鼠从断乳后连续给样40d。
3.3 试验步骤
3.3.1 胎仔情况
活胎数、雌雄比例、死胎数、分娩胎仔总数。于生后第4d将各窝仔鼠数调整一致(8～10只)。
3.3.2 体重及食物利用率
记录出生时及生后4、7、14、21、28、56d幼鼠的体重,并计算断乳后幼鼠的食物利用率。
3.3.3 生理发育指标
记录耳郭分离、门齿萌出、开眼、长毛、阴道开放、睾丸下降时间。
3.3.4 神经发育指标
3.3.4.1 平面翻正试验
将仔鼠仰面置于一木质平面上记录其完全翻正 (以4肢着地为标准) 所需时间及各日龄仔鼠反应的阳性率。仔鼠在生后1～5d进行该项测试,每天1次,每次观察60s。
3.3.4.2 前肢握力试验
将仔鼠的前肢放在一固定在水平位置的横杆上,待其前肢握住横杆后,松开,记录握杆持续时间及各日龄仔鼠握杆阳性率。仔鼠在生后10～25d进行该项测试,每天1次。
3.3.4.3 悬崖回避试验
将仔鼠放置于木板平台边缘,鼠的头和前趾越过边缘,记录60s内向旁移动的时间及各日龄仔鼠反应阳性率。仔鼠在出生后1～5d进行该项测试,每天1次。
3.3.4.4 嗅觉定向试验
将仔鼠放在一长方形通道中间,通道的两头和2个正方形旷场相连,一个旷场放有原窝料,一个旷场放有清洁窝料,记录在60s观察期间,仔鼠向原窝料方向移动的距离,每2cm为一记录单位,若向新窝料方向移动,以负值记录。仔鼠在出生后9、11、13d进行该测试,每天1次,并记录各日龄仔鼠向原窝料方向移动及向新窝料方向移动仔鼠数。
3.3.4.5 听觉警戒试验
将仔鼠放进有一固定噪音的特制箱中,给其一固定的声音刺激 (80dB)。记录每窝仔鼠中出现听觉惊恐反应 (肌肉收缩或夹尾巴抽动) 所占的比例。
3.3.4.6 负趋地性试验
将仔鼠头向下放在一个坡度为25°的粗糙平面上,记录其转头180°所需的时间及各日龄仔鼠反应的阳性率。在出生后的2、4、6、8、10d进行该项测试,每天1次。
3.3.4.7 旋转试验
将仔鼠放在一个特制的平面上,记录其在60s内旋转90°、360°所需的时间及各次试验中各组仔鼠反应的阳性率。仔鼠在出生的2、3、4、5、7、9d进行该项测试,每天1次。
3.3.4.8 视觉发育试验
测试时,抓住动物尾巴,头向下,使之面部和前腿朝向1个平面的边缘,距离充分缩小,但触须不可触及边缘。如果在触须触及边缘之前幼鼠用前爪抓住了边缘,证明触觉发育正常,否则视为未达正常水平。记录各组仔鼠反应的阳性率 (触觉达正常的仔鼠比率)。
3.3.4.9 空中翻正反射试验
在1塑料盒中备有足够量的垫料,将仔鼠从距垫料25cm的空中仰卧位水平落下来。观察仔鼠着地时的体位,以4脚落地平稳为正常,否则为异常。连续测试3次,记录3次中落地正常的次数。在出生第10～15d进行测试。
3.3.4.10 游泳发育试验
将幼鼠放在水温 (25±2)℃的玻璃缸内,根据动物游泳的姿势,4肢利用情况及游泳方向,给予评分。根据得分的高低,评价其游泳能力,发育状况。
发育评价指标参见表12。神经反射行为评价指标参见表13。
表12 发育评价指标一览表
项 目 | 内 容 |
胎仔情况 体 重 发育指标 | 活胎数、雌雄比例、死胎数、分娩胎仔总数 记录出生时及出生后4、7、14、21、28、56d幼鼠的体重 耳郭分离时间 门齿萌出时间 (上、下齿分别记录) 睁眼时间 长毛时间 阴道开放时间 睾丸下降时间 |
表13 神经反射行为评价指标一览表
测试项目 | 测试年龄/d | 评价指标 | 所需仪器 |
平面翻正 前肢握力 悬崖回避 负趋地性 旋转运动 嗅觉定向 听觉警戒 视觉发育 | 1～5 10～25 1～5 2、4、6、8 2、3、4、5、7、9 9、11、13 12、14、16 15、17、19 | 翻正所需时间 抓杆时间 回避所需时间 转向180°所需时间 1min内旋转的度数 向原窝移动的距离 达标所需时间 达标时间 | 平面翻正台 抓杆仪 悬崖回避台 负趋地性测试台 回旋试验台 嗅觉定向仪 听觉惊吓反应室 |
空中翻正 游泳发育 | 10～15 6～25 | 3次测试中翻正所占比例 活动量及活动方式 | 空中翻正反应箱 游泳装置 |
4 数据处理及结果判定
4.1 统计方法
计量资料用方差分析,计数资料用x2检验。
4.2 结果判定
胎仔情况、体重及食物利用率、生理发育指标及神经发育指标中有3项或3项以上试验指标为阳性者,可认为该受试物有促进生长发育的作用。
5 注意事项
行为是机体综合性功能,它的轻微改变可被机体代偿能力所掩盖,而它的表现又受到内、外界其他因素的影响。这些因素包括年龄、性别、种系、训练程度以及受试对象的情绪状态及环境因素等。因此,在行为学实验中要注意和重视以下几个问题:
5.1 常采用1组 (2个以上) 测试方法,形成测试组合 (test battery) 以增加行为学指标的特异性和准确性。
5.2 试验宜在隔音室或半隔音室内进行,室内温度、湿度和光照度应适宜和保持一致。
5.3 最好采用近交系动物。实验前数天将动物移至实验室以适应周围环境,实验者必须天天与动物接触,如喂水、喂食和抚摸动物。动物在24h内有其活动周期,即不同时相处于不同的觉醒水平,故实验应选择适宜时间进行,前后2d的实验要在同一时间内完成。
5.4 减少非特异性干扰,如情绪、注意、动机、觉醒、运动活动水平、应激和内分泌等因素。
五、抗疲劳作用检验方法
1 负重游泳试验
1.1 原理
运动耐力的提高是抗疲劳能力加强最有力的宏观表现,游泳时间的长短可以反应动物运动疲劳的程度。
1.2 仪器
游泳箱 (大小约50cm×50cm×40cm),电子天平,铅皮。
1.3 实验方法
1.3.1 实验动物
成年雄性小鼠,体重18～22g,推荐使用BALB/c小鼠。
1.3.2 剂量设置
设高、中、低、对照四个组,根据推荐的人体每公斤体重日摄入量,扩大10倍作为其中一个剂量组,根据受试物的具体情况另设两个剂量组。经口给样,原则上连续给样30d,也可根据试验需要自行设定给样期限。
1.3.3 实验步骤
末次给予受试物30min后,置小鼠在游泳箱中游泳,水深不少于30cm,水温 (25±0.5)℃,鼠尾根部负荷5%体重的铅皮。记录小鼠自游泳开始至死亡的时间,作为小鼠游泳时间 (min)。
1.4 数据处理及结果判定
游泳时间为计量资料,可以用方差分析。若受试物组游泳时间明显长于对照组游泳时间,且差异有显著性 (P<0.05),可以判定该实验阳性。
1.5 注意事项
1.5.1 每一游泳箱一次放入的小鼠不宜太多,否则互相挤靠,影响实验结果。
1.5.2 水温对小鼠的游泳时间有明显的影响,因此要求各组水温控制一致,以25℃为宜。如果过低可能引起小鼠痉挛,影响实验结果。
1.5.3 铅皮缠绕松紧应适宜。
1.5.4 观察者应在整个实验过程中使每只小鼠四肢保持运动。如果小鼠漂浮在水面四肢不动,可用木棒在其附近搅动。
1.5.5 不同批的小鼠因饲养环境、季节等原因的变化体质上会出现差异,因此受试物组和对照组应采用同一批动物同时进行。
2 爬杆试验
2.1 原理
运动耐力的提高是抗疲劳能力加强最有力的宏观表现,爬杆时间的长短可以反应动物静用力时疲劳的程度。
2.2 材料
爬杆架,直径0.8～1cm,长约25cm的有机玻璃圆棒 (经120目砂纸打磨),上端固定于木板上,下端悬空,距地面约20cm。结构见示意图2。
2.3 实验方法
2.3.1 实验动物
雄性成年小鼠,体重18～22g。推荐使用BALB/C。
2.3.2 剂量设置
同负重游泳试验。
图2
2.3.3 实验步骤
实验时,将爬杆架置于水温15℃、深约10cm的水盆中。末次给予受试物30min后开始实验,将小鼠放在有机玻璃棒上,使肌肉处于静力紧张状态,记录小鼠由于肌肉疲劳从有机玻璃棒上跌落下来的时间,第三次落水时终止实验,累计3次的时间作为爬杆时间。
2.4 数据处理及结果判定
爬杆时间为计量资料,可以用方差分析。若受试物组爬杆时间明显长于对照组爬杆时间,且差异有显著性 (P<0.05),可以判定该实验阳性。
2.5 注意事项
2.5.1 实验前小鼠经筛选,训练数次仍不肯爬杆者,废弃。
2.5.2 杆的质地和光滑程度明显影响小鼠的爬杆时间,要求杆的质地坚硬,光滑程度一致。以免小鼠爪子将杆表面刮损,影响光滑程度。
3 血清尿素氮测定——二乙酰—肟法
3.1 原理
样品中尿素在氯化高铁—磷酸溶液中与二乙酰—肟和硫氨脲共煮,形成一种红色的化合物,其颜色的深浅与尿素含量成正比,与同样处理的尿素标准管比较,可求出其含量。
3.2 仪器和试剂
721分光光度计,10ml带塞试管,1ml(或1.5ml) 塑料离心管,电炉,锅,灌胃针头。
试剂盒,若无试剂盒,可自行配制试剂。
1g/L二乙酰—肟溶液 取二乙酰—肟1.0g,氨基硫脲(thiosemicarbazide) 0.2g,氯化钠4.5g,溶于蒸馏水并加至1000ml。
33g/L三氯化铁溶液 取三氯化铁1.0g溶于浓磷酸20ml中,加蒸馏水10ml,摇匀。
酸溶液 取蒸馏水800ml,慢慢加入浓硫酸50ml,边加边摇,再加入85%磷酸50ml,摇匀。加入33g/L三氯化铁溶液1.5ml,加水至1L。
10mmol/L尿素标准液 (尿素氮28.01mg/dl) 精确称取尿素 (AR)150.3mg溶于16mmol/L苯甲酸溶液并加至250ml。
16mmol/L苯甲酸液 取苯甲酸2.0g溶于蒸馏水1000ml中,加浓硫酸0.8ml。
3.3 实验方法
3.3.1 实验动物
雄性成年小鼠或大鼠,小鼠体重18～22g,大鼠体重160～200g。推荐使用BALB/C小鼠、Wistar或SD大鼠。
3.3.2 剂量分组、给样途径及期限
大鼠以人体推荐量的5倍为基本剂量。其余同负重游泳法。
3.3.3 实验步骤
3.3.3.1 末次给受试物30min后,在温度为30℃的水中游泳90min,采血测定。
3.3.3.2 样本准备
大鼠采尾血,小鼠拔眼球采血0.5ml。草酸盐、肝素或EDTA抗凝的血浆或血清。血清中的尿素在室温下可稳定24h,在4～6℃可稳定7d以上。
3.3.3.3 操作步骤
3.3.3.3.1 试剂盒按照说明书操作。
3.3.3.3.2 自行配制试剂按表14操作。
表14
试剂 | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
血浆/血清/ml 10mmol/L尿素标准液/ml 蒸馏水/ml lg/L肟溶液/ml 酸溶液/ml | 0.05 — — 2.5 2.5 | — 0.05 — 2.5 2.5 | — — 0.05 2.5 2.5 |
充分混匀,置沸水浴准确15min,立即用自来水冷却。用波长520nm,以空白管调零,测各管吸光度 (A值)。
3.3.4 尿素氮含量计算
3.3.4.1 试剂盒方法
3.3.4.2 自配试剂
尿素 (mmol/L)=Au×10/As
尿素氮 (mg/dl) =Au×28.01/As
式中 Au——测定管吸光度
As——标准管吸光度
3.4 结果判定
统计方法可用方差分析。若受试物组高于对照组,且差异有显著性 (P <0.05),可判定为该受试物有减少疲劳小鼠尿素氮产生的作用。
3.5 注意事项
3.5.1 为避免色度转移,应在标本加入后30min内读出吸光度值。
3.5.2 一般标本测定管反应后应澄清,严重脂血可制备血滤液重新测定。
3.5.3 煮沸时间应准确。
4 肝糖原测定——蒽酮法
4.1 原理
蒽酮可与游离糖或多糖起反应,反应后溶液呈蓝绿色,于620nm处有最大吸收。测定其光密度,可以确定糖原的含量。
4.2 仪器和试剂
721型分光光度计,离心机,扭力天平,匀浆器,振荡器,沸水浴,灌胃针头,手术器械,玻璃漏斗,加样器,2ml、5ml、10ml吸量管,20ml带塞刻度试管,10ml带塞离心管。
5%三氯醋酸 (用蒸馏水配) (TCA)
葡萄糖标准液
浓硫酸 (AR)
蒽酮试剂 溶液中含0.05%的蒽酮,1%的硫脲,用72%的H2SO4配制。
①72%H2SO4配制 烧杯中加入280ml蒸馏水,再加入高纯度的浓硫酸720ml(相对密度1.84)。
②蒽酮试剂配法 当H2SO4温度降至80～90℃时放入500mg纯的蒽酮,10g高纯度的硫脲,适当摇动烧杯混匀。冷却后存放于冰箱中,可保存2周。
4.3 实验方法
4.3.1 实验动物
同二乙酰—肟法。
4.3.2 剂量设置、给样途径及给样期限
大鼠剂量以人体推荐食用量扩大5倍作为基本剂量,其余同负重游泳法。
4.3.3 实验步骤
4.3.3.1 样本制备
末次给样后30min,在温度为30℃的水箱中游泳90min,立即处死,取肝脏,经生理盐水漂洗后用滤纸吸干,精确称取肝脏200mg,加入4ml TCA,每管匀浆1min,将匀浆液倒入离心管,以3000r/min离心15min,将上清液转移至另一试管内。在沉淀中再加入4ml TCA,匀浆1min,再次离心15min,取上清液,并与第一次离心的上清液合并,充分混匀。
取1ml上清液放入10ml离心管中 (每样品可做两平行管以保证获得可靠结果),每管加入95%的乙醇4ml,充分混匀至两种液体间不留有界面。用干净塞子塞上,室温下竖立放置过夜 (也可选用将试管放在37～40℃水浴3h)。沉淀完全后,将试管于3000r/min离心15min。小心倒掉上清液并使试管倒立放置10min。
用2ml蒸馏水溶解糖原,加水时将管壁的糖原洗下。如管底的糖原不立即溶解,振荡管子直到完全溶解。
试剂空白 吸2ml蒸馏水到干净离心管中。
标准管 吸0.5ml葡萄糖标准液 (含100mg/dl葡萄糖) 和1.5ml蒸馏水放入同样的管中。
4.3.3.2 测定样品糖原含量
此时将10ml蒽酮试剂用力加入各管,液流 (蒽酮试剂) 直接进入管子中央,保证充分混合好。从管子中注入蒽酮试剂时起,将管子放在冷水龙头下冲凉。在所有管子都达到凉水温度后,将其浸于沸水浴 (水浴深度略高于管子液面) 15min,然后移到冷水浴,冷却到室温。将管内液体移入比色管,在620nm波长,用试剂空白管调零后测定吸光度。并根据标准曲线计算出糖原含量,根据所称取的肝脏质量换算成肝糖原含量(以mg/g肝表示),并进行统计学处理。
4.3.3.3 糖原含量计算
式中 DU——样品管吸光度
DS——标准管吸光度
0.5——为0.5ml葡萄糖标准液中的葡萄糖含量
0.9——为将葡萄糖换算成糖原的系数
4.4 数据处理及结果判定
所得数据为计量资料,可用方差分析或t检验。若受试物组肝糖原含量明显高于对照组,且差异有显著性 (P <0.05),可判定该受试物有促进糖原储备或减少糖原消耗的作用。
4.5 注意事项
4.5.1 测定的实验方法均为定量要求,因此所有取样加试剂均需准确。
4.5.2 糖原测定中冷却、加热时间与氧化还原作用有关,因此时间要控制准确。
4.5.3 蒽酮显色剂不稳定,以临用时配制为宜,注意避免采用绒布或被污染的糖类进入蒽酮反应。
5 乳酸测定
5.1 原理
在铜离子催化下,乳酸与浓硫酸在沸水中反应,乳酸转化为乙醛,乙醛与对羟基联苯反应产生紫色化合物,在波长560nm处有强烈的光吸收,故可进行定量测定。
5.2 仪器与试剂
微量吸管,恒温水浴锅,电热水箱,分光光度计。
4% CuSO4
浓硫酸 (AR)
1% NaF溶液
蛋白沉淀剂 按体积分别取一份10%的钨酸钠,一份1/3 mol/L硫酸,再与28份蒸馏水混合即成。
沉淀剂-NaF混合液 按体积分别取3份沉淀剂,1份1% NaF混合即成。
1.5%对羟基联苯溶液 称取1.5g对羟基联苯溶于100ml热的0.5% NaOH中 (可保存半年)。
乳酸标准储备液(1mg/ml) 称取106.6mg乳酸锂或171mg乳酸钙,以10%的三氯乙酸定容至100ml(室温下可保存半年)。
乳酸标准应用液 (0.01mg/ml) 准确吸取1.0ml乳酸标准储备液,稀释定容至100ml,此液要求现用现配。
5.3 实验方法
5.3.1 实验动物
同二乙酰—肟法。
5.3.2 剂量设置、给样途径与期限
大鼠以人体每日每公斤体重推荐量的5倍为基本剂量,其余同负重游泳法。
5.3.3 实验步骤
5.3.3.1 游泳
末次给样30min后负重2%体重在温度25～30℃的水中游泳60min后停止,安静15min后采血备用,大鼠采尾血,小鼠拔眼球采血。
5.3.3.2 操作步骤
于5ml试管中加入0.48ml 1% NaF溶液,准确吸取全血20μl加入试管底部。用试管上部清液清洗微量吸管数次,再加入1.5ml蛋白沉淀剂,振荡混匀,于3000r/min离心10min,取上清液,按表15操作。
表15
空白管/ml | 标准管/ml | 测定管/ml | |
沉淀剂-NaF混合液 | 0.5 | — | — |
乳酸标准应用液 | 0.5 | ||
上清液 | 0.5 | ||
4% CuSO4 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
浓硫酸 | 3 | 3 | 3 |
充分混匀,置沸水浴加热5min,取出后放入冰水浴冷却10min | |||
1.5%对羟基联苯 0.1 0.1 | 0.1 | ||
上述步骤完成后,摇匀,置30℃水浴30min(每隔10min振摇1次)。取出后放入沸水浴中加热90s,取出冷却至室温,在波长560nm处用5mm光径比色皿比色,空白管调零。
5.3.3.3 血乳酸含量计算
血乳酸含量(mg/100ml) =A测定管/A标准管×100
5.4 数据处理及结果判定
该实验数据属剂量资料,可用方差分析。若受试物组血乳酸含量明显低于对照组,且差异有显著性 (P<0.05),可判定为该项实验阳性。
六、减肥作用检验方法
1 动物试验
1.1 原理
本方法是以高热量食物诱发动物肥胖,再给予受试物,观察动物体重、体内脂肪的变化及对机体健康有无损害。
1.2 仪器
动物天平,解剖器械等。
1.3 实验方法
1.3.1 实验动物
选用雄性断乳大鼠,体重约50g,每组10只。
1.3.2 剂量分组
设对照组及3个剂量组,受试物剂量根据推荐的人体每公斤体重日摄入量,扩大5倍作为其中一个剂量。经口给予受试物,连续30d。
1.3.3 实验步骤
1.3.3.1 建立营养性大鼠肥胖模型
饲料配方如下:
基础饲料 大麦粉20%,脱水菜 (去除水分的包心菜) 10%,豆粉20%,酵母1%,骨粉5%,玉米粉16%,麸皮16%,鱼粉10%,食盐2%。
营养饲料 每100g基础材料中加入奶粉10g,猪油10g,鸡蛋1个,浓鱼肝油10滴(含维生素A 17000IU、维生素D 1700IU),新鲜黄豆芽250g。供应饲料的量为第1、2周内每天每只鼠13g,以后每周增加2g,至第6周止。每日饲料分2次供给,吃完后不再添加。
用上述高脂肪高营养饲料喂断乳大鼠45d后,体重较普通饲料喂养的同龄大鼠体重增加将近一倍。
1.3.3.2 减肥试验
大鼠肥胖模型建立以后,试验组给予受试验,对照组给予相应溶剂。
1.3.3.3 结果观察
a. 体重
b. 体内脂肪质量 (睾丸及肾周围脂肪垫)
1.4 数据处理和结果判定
一般采用方差分析进行统计。受试物组的体重及体内脂肪质量低于对照组,经统计学处理差异有显著性,并且对机体无明显损害,即可初步判定该受试物具有减肥作用。
2 人体试食试验
2.1 原理
单纯性肥胖受试者食用受试物,观察体重、体内脂肪含量的变化及对机体健康有无损害。
2.2 仪器和试剂
体成分测定仪 (密度法),B超,皮卡钳,体重计,血清甘油三酯,总胆固醇,高密度脂蛋白试剂盒,血清总蛋白,白蛋白试剂盒等。
2.3 实验方法
2.3.1 受试对象
受试对象为单纯性肥胖人群,不得有胆囊疾患。
2.3.2 受试人数
至少30人。
2.3.3 受试物给予时间
一般要求5周。
2.3.4 观察指标
2.3.4.1 体重,身高,腰、腹、臀围,并计算标准体重、体重指数、超重度、腰臀比等。
成年人标准体重 (kg) = [身高 (cm) -100] ×0.9
儿童、青少年应用身高-标准体重表确定其标准体重
2.3.4.2 体内脂肪含量的测定
体内脂肪总量(kg)和脂肪占体重百分率(%),用密度法。
皮下脂肪厚度用B超测定法或皮卡钳法,4个测定位点见表16。
表16
A点 B点 C点 D点 | 右三角肌下缘臂外侧正中点 右肩胛下角 右脐旁3cm 右髂前上棘 |
2.3.4.3 生化测定
血糖,血脂(血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白等),血红蛋白,白蛋白,总蛋白测定 (计算白球比)、尿酸,酮体。
2.3.4.4 运动耐力测试
2.3.4.5 其他不良反应如厌食、腹泻等。
2.4 数据处理和结果判定
一般采用方差分析进行统计。根据试验前后上述指标测定结果进行综合评价,其中体内脂肪含量经统计学处理差异有显著性,且对机体健康无明显损害,可判定该受试物具有减肥作用。
七、耐缺氧作用检验方法
常压耐缺氧试验
1 原理
缺氧对机体是一种劣性刺激,影响机体各种代谢,特别是影响机体的氧化功能,最终会导致机体的心、脑等主要器官缺氧供能不足而死亡。
2 材料
250ml磨口广口瓶,秒表,凡士林,钠石灰 (或等量氢氧化钠和碳酸钙)。
3 实验方法
3.1 实验动物
选用6～8周 (18～20g) 小鼠,雌雄均可,单一性别每组不少于10只。
3.2 剂量分组
按体重随机分为1个对照组和3个剂量组,人每公斤体重日推荐摄入量的10倍为其中一个剂量,另外2个剂量根据受试物的具体情况,在这个剂量基础上,上下浮动。
3.3 实验步骤
经口连续给予受试物20～30d,于末次给予受试物后1h,将各组小鼠分别放入盛有15g钠石灰的250ml广口瓶内 (每瓶只放1只小鼠),用凡士林涂抹瓶口,盖严,使之不漏气,立即计时,以呼吸停止为指标,观察小鼠因缺氧而死亡的时间。将观察结果填入表17。
表17
组别 | 剂量 | 动物数/只 | 存活时间/min |
对照组 受试物组 |
4 统计方法及结果判定
采用方差分析处理数据。受试物组与对照组比较,存活时间延长,经统计差异有显著性 (P<0.05),则判定该受试物具有耐缺氧作用。
5 注意事项
5.1 每个广口瓶内最好只放1只小鼠,以防互相干扰影响耐缺氧能力的测定。
5.2 广口瓶一定要密闭封严,以防漏气,否则会影响试验结果。
5.3 广口瓶容积应适当,以小鼠能自由活动为宜。
八、抗辐射作用检验方法
1 亚急性试验
1.1 原理
一次性大剂量全身60Co-γ射线照射引起的急性辐射损伤主要表现为动物平均生存时间缩短、存活率下降、白细胞数目减少等。
1.2 仪器和试剂
血球计数板,显微镜,1%盐酸等。
1.3 实验方法
1.3.1 实验动物
18～20g昆明种小鼠,雌雄均可,每组20只。
1.3.2 剂量分组
设辐照对照组及3个剂量组,受试物剂量根据推荐的人体每公斤体重日摄入量,扩大10倍作为其中一个剂量。受试物于照射前后经口连续给予,每天1次,连续30d。
1.3.3 实验步骤
受试物组于照射前后经口连续给予受试物,受试物组与辐射对照组均以同一剂量照射1次,照射剂量宜选择LD90左右 (7～8Gy)。照射后一半动物取血作白细胞计数,另一半动物观察平均存活时间或30d存活率。
白细胞计数 在0.39ml 1%盐酸中加入10μl全血,计数计算池四个大方格中白细胞总数。
白细胞数 (个/mm3) =四个大方格中白细胞总数×100
1.4 数据处理及结果判定
30d存活率用卡方检验; 白细胞计数及平均存活时间用方差分析。受试物组与辐射对照组比较,如果平均存活时间延长或30d存活率增高,以及白细胞总数增多,经统计学处理差异有显著性,则可判定该受试物对较高剂量一次性照射有拮抗作用。
2 亚慢性试验或慢性试验
低剂量长期照射引起动物慢性辐射损伤主要敏感器官是骨髓和睾丸。
2.1 小鼠骨髓细胞微核试验
2.1.1 原理
可应用微核试验检测辐射对整体哺乳动物骨髓细胞染色体的损伤作用,如果在辐射同时给予受试物,即可研究该受试物对染色体损伤的保护作用,即抗辐射作用。
2.1.2 仪器和试剂
解剖器械,生物显微镜,载玻片等。
小牛血清 小牛血清滤菌后放入56℃恒温水浴保温1h进行灭活。通常储存于4℃冰箱冰盒里。亦可用大、小鼠血清代替。
Giemsa染液及应用液
1/15mol/L磷酸盐缓冲液 (pH 6.8)
甲醇 (分析纯)
阳性物 环磷酰胺
2.1.3 实验方法
2.1.3.1 实验动物
昆明小鼠,7～12周龄,体重25～30g,雌雄均可,每组10只。
2.1.3.2 剂量分组
设辐照对照组及3个剂量受试物组,根据推荐的人体摄入量,扩大10倍作为其中一个剂量。受试物经口给予,时间至少3个月。
2.1.3.3 实验步骤
照射剂量 累计剂量为半数致死剂量的1/2,连续照射,每天1次,同时给予受试物,至少3个月。试验结束时,处死动物,取胸骨制片固定,染色,镜检。每只动物计数1000个嗜多染红细胞中微核细胞数,微核率以千分率表示。
2.1.4 数据处理及结果判定
一般采用泊松分布进行统计。受试物组微核率低于辐射对照组微核率,经统计处理差异有显著性,则可判定该受试物的该项抗辐射试验阳性。
2.2 小鼠睾丸染色体畸变试验
2.2.1 原理
可应用小鼠睾丸染色体畸变试验检测辐射对整体哺乳动物睾丸生殖细胞染色体的损伤作用,如果在辐射同时给予受试物,即可研究该受试物对染色体损伤的保护作用,即抗辐射作用。
2.2.2 仪器和试剂
实验室常用设备,离心机,生物显微镜。
1%柠檬酸三钠 (分析纯) 取1g柠檬酸三钠加蒸馏水至100ml,宜新鲜配制。
60%冰乙酸 (分析纯) 取60ml冰乙酸加蒸馏水至100ml,宜新鲜配制。
2.2.3 实验方法
2.2.3.1 实验动物
选用健康成年雄性昆明种小鼠,体重25～30g,每组10只。
2.2.3.2 剂量分组
设辐照对照组及3个剂量受试物组,受试物剂量根据厂家推荐的人体每公斤体重日摄入量,扩大10倍作为其中一个剂量组。
2.2.3.3 实验步骤
照射剂量 累计剂量为半数致死剂量的1/2,连续照射,每天1次,同时给予受试物至少3个月。动物处死前6h腹腔注射秋水仙素4～6mg/kg。以颈椎脱臼法处死小鼠,取出两侧睾丸,去净脂肪,于低渗液中洗去毛和血污,放入盛有适量1%柠檬酸三钠或0.4%氯化钾溶液的小平皿中。以眼科小镊子撕开被膜,轻轻地分离开曲细精管,室温下低渗,低渗时间视具体条件而定 (一般为20～40min为宜)。仔细吸尽低渗液,加固定液 (甲醇: 冰乙酸=3:1)10ml,固定20min。吸尽固定液,加60%冰乙酸1～2ml,待大部分曲细精管软化完后,立即加入倍量的固定液,打匀,移入离心管,以1000r/min离心10min,弃去大部分上清液,留下0.5～1.0ml,充分打匀制成细胞混悬液,将细胞混悬液均匀地滴于冰水玻片上,每个样本制片2～3张,空气干燥或微热烘干,用1:10Giemsa液(pH6.8)染色20～40min。
畸变分析 参见GB15193.8-94“食品安全性毒理学评价程序和方法” 中的 “小鼠睾丸染色体畸变试验”。
2.2.4 数据处理与结果判定
受试物组与致突变物对照组的断片、易位、畸变细胞率、常染色体单价体、性染色体单价体等分别按Kastenbaum和Bowman所述方法进行统计处理,若差异有显著性,则可判定该受试物的该项抗辐射试验阳性。
九、抗突变作用检验方法
1 修改的Ames试验
1.1 原理
用于检测化学物质致突变作用的鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验,经修改,可在以下方面研究受试物的抗突变作用:
受试物直接灭活致突变物;
受试物抑制致突变物对菌株的致突变作用;
受试物抑制已受致突变作用的菌株的突变表达。
1.2 仪器和试剂
1.2.1 仪器
实验室常用设备,低温高速离心机,低温冰箱 (-80℃) 或液氮罐,洁净工作台,恒温培养箱,恒温水浴,蒸汽压力锅,匀浆器等。
1.2.2 试剂
参见GB15193.4-94 “食品安全性毒理学评价程序和方法” 中的 “鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验”。
用于存活试验的磷酸盐缓冲液 (pH 7.0) 每100ml由以下成分组成:
磷酸二氢钾 (KH2PO4) (1.77g/100ml) 24ml
磷酸二氢钠(NaH2PO4) (1.77g/100ml) 76ml
阳性诱变物 针对不同菌株,选用针对性致突变物 (直接或间接致突变物均可)。
1.3 实验方法
1.3.1 菌株
一般选用经鉴定合格的TA98或TA100。
1.3.2 剂量分组
设致突变物对照组及受试物组,受试物组至少设3个剂量。根据受试物理化性质及细胞毒性,确定最高剂量,每个剂量组做3个平皿。
1.3.3 实验步骤
基本方法参见GB15193.4-94 “食品安全性毒理学评价程序和方法” 中的鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验,针对抗突变作用不同,修改如下:
受试物直接灭活致突变物 0.1ml致突变物及0.1ml受试物同时加入0.5ml磷酸盐缓冲液 (0.2mol/L,pH7.4),加或不加S-9,于37℃水浴预培养20min,再加入0.1ml菌液,该悬液取适量做细菌存活试验后,其余一同加入2ml融化的 (45℃水浴) 顶层培养基,迅速倾入底层培养基,平放固化,37℃培养48h,计数菌落数。
受试物抑制致突变物对菌株的致突变作用 0.1ml受试物、0.1ml致突变物与0.1ml菌液共同加入0.5ml磷酸盐缓冲液 (0.2mol/L,pH 7.4),加或不加S-9,于37℃水浴预培养20min,该悬液取适量做细菌存活试验后,其余一同加入2ml融化的 (45℃水浴)顶层培养基,迅速倾入底层培养基,平放固化,37℃培养48h,计数菌落数。
受试物抑制已受致突变作用的菌株的突变表达 0.1ml致突变物与0.1ml菌液同时加入0.5ml磷酸盐缓冲液(0.2mol/L,pH 7.4),加或不加S-9,于37℃水浴预培养20min,然后离心 (1000r/min,5min),再用磷酸盐缓冲液(0.2mol/L,pH 7.4) 冲洗(即加入缓冲液后离心沉淀细菌,弃上清液) 2次,洗后剩0.7ml菌液,再加入0.1ml受试物,该悬液取适量做细菌存活试验后,其余一同加入2ml融化的 (45℃水浴) 顶层培养基,迅速倾入底层培养基,平放固化,37℃培养48h,计数菌落数。
存活试验 (即细菌活力鉴定) 将细菌悬液用磷酸盐缓冲液稀释106倍,取0.1ml稀释液加入2ml融化的 (45℃水浴) 顶层培养基,倾入营养肉汤琼脂平板,平放固化,37℃培养24h,计数菌落数。
计数各平皿菌落数,按下列公式计算相对菌落形成率、相对菌落数及抑制率。
相对菌落形成率计算:
式中 A——相对菌落形成率
B——受试物组菌落数
C——溶剂对照组菌落数
相对菌落数计算:
式中 D——相对菌落数
E——各组实际菌落数
抑制率计算:
式中 F——抑制率
G——致突变物对照组相对菌落数
H——受试物组相对菌落数
I——溶剂对照组相对菌落数
1.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行统计。受试物组相对菌落数低于致突变物组相对菌落数,经统计学处理差异有显著性,并且可重复,则可判定该受试物的该项抗突变试验阳性。
2 体外哺乳类细胞 (V79/HGPRT) 基因突变试验
2.1 原理
细胞在正常培养条件下,对6-TG的毒性作用敏感,不能生存,在致癌物和致突变物作用下,某些细胞X染色体上控制次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HGPRT) 结构基因发生突变,不能再产生HGPRT,从而使突变细胞对6-TG具有抗性作用。这些突变细胞在含有6-TG的选择性培养液中能继续分裂并形成集落。将受试物与已知致突变物共同作用于V79细胞,根据突变集落形成数,检测受试物的抗突变作用。
2.2 仪器和试剂
参见GB15193.12-94 “食品安全性毒理学评价程序和方法” 中的 “体外哺乳类细胞(V79/HGPRT) 基因突变试验”。
培养基 采用MEM (Eagle) 基础培养液或DMEM培养液,补以10%小牛血清及适量抗菌素 (青、链霉素)。
磷酸盐缓冲液 (无钙、镁、PBS)
胰蛋白酶/EDTA溶液
阳性致突变物 丝裂霉素C (MMC)、甲基磺酸乙酯 (EMS) 等。
2.3 实验方法
2.3.1 细胞
中国仓鼠肺V79细胞株。为了减少自发突变率,正式实验前先将野生型细胞群体中存在的自发HGPRT作为突变体选择性杀灭,方法是将野生型细胞接种于含次黄嘌呤及胸嘧啶,氨甲喋呤,甘氨酸的MEM培养液中培养7d,然后重新接种于MEM培养液中。
2.3.2 剂量分组
设致突变物对照组及受试物组,受试物组设3个剂量,根据受试物理化性质及细胞毒性作用,确定最高剂量。
2.3.3 实验步骤
将5×105个细胞接种于直径为100mm平皿中,于37℃,5%CO2培养箱中放置24h。吸去培养液,PBS洗2次,加入无血清培养液及一定浓度的受试物及阳性物,置
于培养箱中2h,结束后吸去培养液,换入含10%血清的培养液,继续培养19～20h。消化计数,以5×105个细胞接种于直径100mm的平皿,3d后分传1次,仍接种5×105个细胞培养3d。共表达6d。
突变体的选择及集落形成率的测定 表达结束后,消化细胞,每组5个皿,每皿种2×105个细胞,待细胞贴壁后加入6-TG,终浓度为5μg/ml。培养8～10d后固定,Giemsa染色,计数每皿集落数并计算突变率。同时另做集落形成率测定,每皿接种200个细胞,不加6-TG。每组5个平皿,7d后固定染色,计算集落形成率。
2.4 数据处理及结果判定
一般采用泊松分布进行统计。若受试物组突变率低于致突变物对照组突变率,经统计学处理差异有显著性,则可判定该受试物该项抗突变试验阳性。
3 修改的小鼠骨髓细胞微核试验
3.1 原理
微核试验是用于检测化学物质对整体哺乳动物骨髓细胞染色体的损伤作用,如果预先给予受试物,再使用固定剂量的某种已知的染色体断裂剂,即可研究该受试物对整体哺乳动物染色体损伤的保护作用,即抗突变作用。
3.2 仪器和试剂
参见GB15193.5-94 “食品安全性毒理学评价程序和方法” 中的 “骨髓微核试验”。
小牛血清
Giemsa染液及应用液
1/15mol/L磷酸盐缓冲液 (pH 6.8)
甲醇 (分析纯)
阳性物 环磷酰胺
3.3 实验方法
3.3.1 实验动物
昆明小鼠,7～12周龄,体重25～30g,雌雄均可。
3.3.2 剂量分组
设致突变物对照组及3个剂量组,受试物剂量根据推荐的人体每公斤体重日摄入量,扩大10倍作为其中一个剂量。受试物经口给予,连续30d。
3.3.3 实验步骤
参见GB15193.5-94 “食品安全性毒理学评价程序和方法” 中的 “骨髓微核试验”。受试物组预先连续给予受试物,每天1次,试验末期 (最后两天) 受试物组及致突变物对照组经口给予致突变物 (环磷酰胺40mg/kg体重) 两次(中间隔24h),第一次受试物组给予致突变物1h后再给予受试物,第二次给予阳性物后6h,取动物胸骨制片,固定、染色、镜检,每只动物计数1000个嗜多染红细胞中微核细胞数,微核率以千分率表示。
3.4 数据处理及结果判定
一般采用泊松分布进行统计。受试物组微核率低于致突变物对照组微核率,经统计学处理差异有显著性,则可判定该受试物的该项抗突变试验阳性。
4 小鼠睾丸染色体畸变试验
4.1 原理
小鼠睾丸染色体畸变试验,是用于检测化学物质对整体哺乳动物睾丸生殖细胞染色体的损伤作用,如果使用固定剂量的某种已知的致突变剂前后均给予受试物,即可研究该受试物对整体哺乳动物睾丸生殖细胞染色体损伤的保护作用,即抗突变作用。
4.2 仪器和试剂
实验室常用设备,离心机,生物显微镜。
1%柠檬酸三钠 (分析纯) 取1g柠檬酸三钠加蒸馏水至100ml,宜新鲜配制。
60%冰乙酸 (分析纯) 取60ml冰乙酸加蒸馏水至100ml,宜新鲜配制。
4.3 实验方法
4.3.1 试验动物
选用健康成年雄性昆明种小鼠,体重25～30g,每组10只。
4.3.2 剂量分组
设致突变物对照组及3个剂量受试物组,受试物剂量根据推荐的人体每公斤体重日摄入量,扩大10倍作为其中一个剂量。受试物经口给予,连续30d。
4.3.3 实验步骤
参见GB15193.8-94 “食品安全性毒理学评价程序和方法” 中的 “小鼠睾丸染色体畸变试验”。
4.3.3.1 受试物组连续给予受试物,每天1次,取材前第12～14d受试物组及致突变物对照组经口给予丝裂霉素C (1.5～2mg/kg体重) 1次,受试物组继续给予受试物12～14d(给予丝裂霉素C1h后再给予受试物)。各组均于给予致突变物后的第12～14d将动物处死取材制片。
4.3.3.2 动物处死前6h腹腔注射秋水仙素4～6mg/kg体重 (按0.1～0.2ml/10g体重给予受试物),秋水仙素宜当天新鲜配制。
4.3.3.3 以颈椎脱臼法处死小鼠,取出两侧睾丸,去净脂肪,于低渗液中洗去毛和血污,放入盛有适量1%柠檬酸三钠或0.4%氯化钾溶液的小平皿中。
4.3.3.4 以眼科小镊子撕开被膜,轻轻地分离开曲细精管,室温下低渗,低渗时间视具体条件而定 (一般20～40min为宜)。
4.3.3.5 仔细吸尽低渗液,加固定液 (甲醇: 冰乙酸=3:1) 10ml,固定20min。
4.3.3.6 吸尽固定液,加60%冰乙酸1～2ml,待大部分曲细精管软化完后,立即加入倍量的固定液,打匀,移入离心管,以1000r/min离心10min。
4.3.3.7 弃去大部分上清液,留下0.5～1.0ml,充分打匀制成细胞混悬液,将细胞混悬液均匀地滴于冰水玻片上。每个样本制片2～3张。空气干燥或微热烘干。
4.3.3.8 用1:10Giemsa液 (pH 6.8) 染色20～40min。
4.3.3.9 畸变分析 参见GB15193.8-94 “食品安全性毒理学评价程序和方法”中小鼠睾丸染色体畸变试验。
4.4 数据处理与结果判定
受试物组与致突变物对照组的断片、易位、畸变细胞率、常染色体单价体、性染色体单价体等分别按Kastenbaum和Bowman所述方法进行统计处理,若差异有显著性,则可判定该受试物的该项抗突变试验阳性。
十、抑制肿瘤作用检验方法
1 动物移植性肿瘤试验
1.1 原理
使一批动物同时接种同样量的瘤细胞,并使其在体内生长,给予受试物一段时间后,观察瘤重或动物平均存活天数。
1.2 仪器和试剂
洁净工作台,无菌解剖器械,生理盐水等。
1.3 实验方法
1.3.1 实验动物
健康动物,雌雄均可,但同一批试验中受试物组与对照组性别必须相同,小鼠体重18～22g,大鼠体重50～70g,每组动物小鼠至少10只,大鼠至少8只,裸鼠可用5～10只。
1.3.2 肿瘤模型
1.3.2.1 小鼠肿瘤
肉瘤180 (S—180),肉瘤37 (S—37),艾氏癌腹水型(EAC),艾氏癌实体型(EC),肝癌实体型(Heps),Harding-Passey黑色素瘤,未分化型胶质瘤G422等,可用昆明种小鼠。小鼠网织细胞白血病 (L 615) 应用纯种615小鼠。小鼠淋巴细胞白血病L1210和P 388应用纯种DBA/2或CDF小鼠或BDF小鼠。Lewis肺癌,黑色素瘤B16,小鼠乳腺癌 (M 5076),应用C 57BL/6纯种小鼠或BDF或CDF小鼠。
1.3.2.2 大鼠肿瘤
瓦克癌肉瘤 (W256),软骨肉瘤,吉田肉瘤腹水型,用Wistar,Sprague-Dawley或Fisher大白鼠。
1.3.2.3 人肿瘤细胞株
国际上常用的细胞株,如人口腔癌细胞株KB细胞,宫颈癌细胞株HeLa细胞,卵巢癌细胞株A 2780及国内建立的食管癌,肺癌及肝癌细胞株等皆可使用。
以上肿瘤模型任选一种。
1.3.3 剂量分组
受试物经口给予,连续30d,可在接种前开始给受试物,接种肿瘤后停用或继续给受试物,接种前给受试物天数由肿瘤接种成活率决定 (观察是否比肿瘤模型对照组低)。
设肿瘤模型对照组及3个受试物组,受试物剂量根据推荐的人体每公斤体重日摄入量,小鼠扩大10倍作为其中一个剂量,大鼠扩大5倍作为其中一个剂量。应设已知受试物的抑制肿瘤阳性对照组。
1.3.4 实验步骤
1.3.4.1 一般要求
需在无菌条件下进行。可在接种罩、超净工作台或无菌室内操作。动物处死后,用新洁尔灭 (1:1000) 或碘酊、酒精消毒,对每个实体瘤应分别用灭菌的外科器械切取,对腹水瘤则应分别用灭菌的空针抽吸。瘤块污染常是接种失败的主要原因,应予注意。在高温季节操作时,应注意降温,可在盛有瘤源的器皿周围放置冰块。
常用腋下部位皮下作为实体瘤接种部位,肌肉接种则用大腿肌肉,腹水型接种于腹腔。
1.3.4.2 瘤块的制备
接种用的瘤块应选择接种后7～10d、肿瘤生长旺盛且无溃破而动物健康较好的瘤源动物,颈椎脱臼,固定于蜡板上,用碘酊及酒精消毒操作部位皮肤 (消毒面应尽可能大一些)。切开皮肤、选择生长良好无坏死或液化的瘤组织。在无菌平皿内,剪成2～3mm3的小块。平皿内放置少许消毒的生理盐水缓冲液或其他营养液,以保存瘤块。平皿应放置在冰块上。用无菌套管针抽吸或向套管针内塞进一小瘤块,接种于同种受体动物右前肢腋窝皮下(接种部位皮肤应先用碘酊、酒精消毒)。接种操作时间应尽可能的缩短,从一个瘤块所取的材料一般应在30min内接种完。
1.3.4.3 瘤细胞悬液的制备
如每次需要接种的动物数量较多时,可用瘤细胞悬液接种。具体方法为,在无菌操作下取瘤块,除去坏死组织,将数个瘤块混合,剪成小块,用玻璃组织匀浆器研磨,磨匀后放入无菌容器内,加生理盐水适量稀释成1:3～1:4的瘤细胞悬液。容器置冰块上,用空针抽吸,每次抽吸前应将细胞混匀。每个动物接种0.2mL。整个操作应在30min内完成。
停止给予受试物之次日 (或停止给予受试物后1～5d) 处死动物,先称体重,后解剖皮下瘤块,称重。如对照组小白鼠肿瘤平均质量小于1g或20%鼠的瘤重小于400mg,大白鼠肿瘤平均质量小于2g,表示肿瘤生长不良。在试验期间给受试物组鼠死亡超过20%,或平均体重 (去瘤后) 下降 (自身对照) 超过15%者,表示受试物的毒性反应,应当减少剂量重新试验。
1.3.4.4 腹水型肿瘤悬液的制备。
1.3.4.4.1 抽取腹水
选择接种后7～10d健康较好的动物,颈椎脱臼,固定于蜡板上,腹部皮肤消毒后,剪开并剥去腹部皮肤,用空针穿过腹部肌肉,抽吸腹水,放入无菌容器内,置冰块保存。若用几只动物供瘤时,应将腹水混合。另取小量腹水,置于加有肝素的干试管内,作为观察细胞形态及细胞计数用。将空针中剩余的腹水,滴1滴于载玻片上,推片,瑞氏染色,镜下进行细胞分类计数,其中瘤细胞数应≥95%。
抽出之腹水应为乳白色之浓稠液体,若为黄色或有大量红细胞应弃去。
1.3.4.4.2 细胞计数
取置于肝素管内的细胞。用生理盐水稀释10倍及100倍。取稀释液0.9ml,加台盼蓝 (0.2%台盼蓝生理盐水液)0.1ml,混匀。用白细胞计数法计瘤细胞总数。同时计算受感染的死细胞数。因瘤细胞死后,细胞膜的通透性改变,细胞可被台盼蓝染成蓝色。
1.3.4.4.3 接种
腹水用无菌含葡萄糖的平衡盐水 (如Hanks氏液、Gey氏液、洛氏液、Earle氏液等) 稀释至适当的浓度,作腹腔注射,每鼠注入0.1～0.2ml。整个操作应在60min内完成。
一般在试验结束后次日称体重,逐日记录。对照组动物通常在2～3周内全部死光,个别存活时间太长者需剔除,但各组亦应相应地剔除1只。如试验期间对照组动物于7d内死亡≥20%,表示试验失败。如对照组内20%动物存活4周以上,实验亦应作废。受试物组观察时间一般为60d(生存超过此时限者,仍按60d计算)。分别记录对照组和受试物组的平均生存时间。
1.3.4.5 白血病株的接种
腹水型白血病如L1210及P388的接种同腹水型肿瘤接种法。L615小白鼠白血病的接种则按下述方法进行。取L615白血病小白鼠 (约接种后第6天),颈椎脱臼,在无菌条件下,剪取脾脏一小块 (约米粒大小),放置玻璃组织匀浆器内,加少量无菌生理盐水,制成细胞悬液,并稀释至8～9ml,取一定量加0.2%台盼蓝缓冲液,计每毫升悬液的活细胞数 (台盼蓝终浓度为0.02%)。根据活细胞数值适当稀释悬液将细胞数调整至4×107个/ml,接种于小鼠皮下,每鼠接种细胞悬液0.1～0.2ml。
1.4 数据处理及结果判定
采用方差分析进行统计。肿瘤模型对照组与受试物组比较,实体瘤瘤重或腹水瘤及白血病生存时间,经统计学处理差异有显著性,并且经2批动物重复试验验证,则可判定该受试物该项试验阳性。
2 动物诱发性肿瘤试验
2.1 原理
动物通过化学诱导可形成与人体癌相类似的肿瘤模型,预先或同时给予受试物,观察其是否影响肿瘤发生率或瘤重或生存时间。
2.2 致癌物
黄曲霉毒素B1-初生小鼠肝癌
甲基胆蒽-小鼠肉瘤及皮肤癌
二甲基肼-大鼠结肠癌
二甲基苯蒽-大鼠乳腺癌
N-亚硝基甲基脲-大鼠乳腺癌
N-二甲基亚硝胺-大鼠肝、肺、肾脏肿瘤
二乙基亚硝胺-大鼠肝癌
甲基亚硝基胍-大鼠胃癌 (只能灌胃)
亚硝基肌氨酸-大鼠食管/前胃癌
亚硝基呱嗪-大鼠鼻咽/鼻腔癌及其癌前期
2.3 实验方法
2.3.1 实验动物
一般选择大白鼠或小白鼠,雌雄均可,根据致癌物诱癌的发生率决定动物的数量。
2.3.2 剂量分组
设致癌物对照组,阴性对照组及3个受试物组。受试物剂量根据推荐的人体每公斤体重日摄入量,小鼠扩大10倍作为其中一个剂量,大鼠扩大5倍作为其中一个剂量。受试物经口给予,给予时间由致癌物对照组肿瘤发生的时间决定。
2.3.3 实验步骤
致癌物对照组连续给予致癌物,阴性对照组给予溶剂,受试物组除给予致癌物外同时或预先给予受试物,试验结束,观察各组肿瘤发生率或瘤重或生存时间。
2.4 数据处理及结果判定
采用卡方检验或方差分析进行统计。受试物组与致癌物对照组比较,肿瘤发生率或瘤重或生存时间,经统计学处理差异有显著性,则可判定该受试物该项试验阳性。
3 免疫功能试验
参见“保健食品的功能学评价程序和检验方法” 中免疫调节作用
3.1 NK细胞活性测定
3.2 单核—巨噬细胞功能测定
十一、调节血脂作用检验方法
1 原理
用高胆固醇和脂类饲料喂养动物可形成实验性高脂血症,再给予受试物或同时给予受试物。可检测受试物对高脂血症的影响,并可判定受试物对脂质的吸收、脂蛋白的形成、脂质的降解或排泄产生的影响。
2 仪器和试剂
解剖器械,721分光光度计,自动生化分析仪,胆固醇,胆盐,血清总胆固醇(TC),甘油三酯 (TG),高密度脂蛋白HDL-C测定试剂盒。
3 动物选择及饲料
3.1 健康成年雄性 (或雌、雄各半) 大鼠 (150～200g),说明种系,最好选用Wistar或SD种大鼠 (具有批准号),每组至少8只。
3.2 高脂饲料
3.2.1 79%基础饲料,1%胆固醇,10%蛋黄粉和10%猪油;
3.2.2 93.8%基础饲料,1%胆固醇,5%猪油,0.2%胆盐。
4 受试物及剂量分组
所测受试物应根据其理化特性配成溶液或混悬液给动物灌胃,每日1次。整个试验应设有高脂对照组,三个剂量组,必要时设阳性对照组。
5 实验步骤
5.1 大鼠脂代谢紊乱模型
在实验的环境下大鼠喂饲基础饲料观察5～10d,然后取尾血,分别测定其各项血脂,观察指标的正常值。
根据血脂水平,进行随机分组,在给予高脂饲料的同时给予不同剂量的受试物,为期14～28d,定期称量体重,于实验的第14d和/或28d时,测各项血脂指标。
5.2 自正式实验开始各组动物换用高脂饲料喂饲7～10d,取尾血,测定血脂以确定是否已形成高脂血症。再根据TC水平,进行随机分组,受试物经口灌胃,为期14～28d,高脂对照组给同体积的溶剂,继续给予高脂饲料,并定期称量体重,于实验开始的第2和/或4周时,取尾血,测定血脂各项指标。
6 观察指标
必做项目 血清总胆固醇 (TC)
甘油三酯 (TG)
高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C)
选做项目 低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C)
极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)
7 结果判定
在高脂血症模型成立时,TC、TG、HDL-C三项指标中任何一项阳性时,均可认为该受试物具有调节血脂的作用。
阳性判定: ①与高脂模型组相比,差异有显著性,最好呈现剂量反应关系。
②TC下降>10%; TG下降>15%; HDL-C升高4mg/dl。
8 注意事项
8.1 在建立动物模型中,可因动物品系、饲养管理而影响模型的建立。
8.2 保证基础饲料的各种营养成分,最好自配饲料。
十二、改善性功能作用检验方法
1 大鼠交配试验
1.1 原理
观察受试物对成年大鼠交配的影响,一般观察扑捉潜伏期、扑捉次数、扑捉率、交配潜伏期、交配次数、交配率等指标,以判断受试物对雄性大鼠性交能力的影响。
1.2 试剂
0.6%戊巴比妥钠,0.1%苯甲酸雌二醇注射液,2%黄体酮注射液,青霉素。
1.3 实验方法
1.3.1 实验动物
出生3个月左右的Wistar或SD种性成熟大鼠,每组20只,雌雄各半。
1.3.2 剂量分组
设1个阴性 (蒸馏水) 对照组和3个受试物剂量组,必要时可增设溶剂对照组和阳性对照组。3个受试物剂量中,其中1个应是人每公斤体重日推荐摄入量的5倍,另2个剂量根据受试物的具体情况上、下浮动。
1.3.3 实验步骤
1.3.3.1 雌性大鼠准备
雌性大鼠在0.6%戊巴比妥钠 (45mg/kg) 麻醉下,行双侧卵巢切除术,术后肌注青霉素2万U/kg,连续3d。卵巢切除2周后方可进行试验。试验前48h皮下注射苯甲酸雌二醇20ng/只,试验4h前再次经皮下注射黄体酮注射液500μg/只。
1.3.3.2 雄性大鼠准备
雄性大鼠按剂量每日灌胃给受试物1次,连续15～30d。
1.3.3.3 交配试验
将雄性大鼠单独放入笼内5min,使其适应环境,然后,每笼放入一只雌鼠,开始记录下列指标:
1.3.3.3.1 扑捉潜伏期 自雌鼠投入至雄鼠第一次扑捉雌鼠时间 (时间以秒计)
1.3.3.3.2 扑捉次数 20min内各组雄鼠平均扑捉雌鼠次数
1.3.3.3.3 扑捉率 20min内各组雄鼠扑捉雌鼠的发生率
1.3.3.3.4 交配潜伏期 自雌鼠投入至雄鼠第一次射精时间 (时间单位以秒计)
1.3.3.3.5 交配次数 20min内各组雄鼠平均射精次数
1.3.3.3.6 交配率 20min内各组雄鼠射精的发生率
1.4 数据处理及结果判定
试验数据采用方差分析方法。受试物组与对照组比较,至少一项指标呈阳性并经统计学处理有显著性差异 (P<0.05),即可判定该受试物交配试验阳性。
2 小鼠交配试验
任选下列方法之一。
2.1 正常雄性小鼠交配试验
2.1.1 原理
观察受试物对成年雄性小鼠交配的影响,一般观察交配潜伏期、交配次数等指标,以判断受试物对雄性小鼠性交能力的影响。
2.1.2 实验方法
2.1.2.1 实验动物
成年雄性小鼠,每组10只; 成年雌性小鼠,每组30只。
2.1.2.2 剂量分组
设1个阴性 (蒸馏水) 对照组和3个受试物剂量组,必要时可增设溶剂对照组和阳性对照组。3个受试物剂量中,其中1个应是人每公斤体重日推荐摄入量的10倍,另2个剂量根据受试物的具体情况上、下浮动。
2.1.2.3 实验步骤
每天给雄性小鼠受试物1次,连续21d。于最后一次给受试物30min后,将成年雌性小鼠与雄性小鼠合笼 (雌:雄=3:1),置于暗室内观察,记录合笼至第一次交配的时间 (交配潜伏期) 以及20min内交配次数。
2.1.3 数据处理及结果判定
试验数据采用方差分析方法。受试物组与对照组比较,至少一项指标呈阳性并经统计学处理有显著性差异 (P<0.05),即可判定该受试物交配试验阳性。
2.2 慢性悬吊应激性功能紊乱模型交配试验
2.2.1 原理
雄性小鼠处于慢性悬吊应激状态时,性功能可见明显下降。以此为模型,观察受试物提高小鼠性功能的作用强度和效力。一般观察交配潜伏期、交配次数等指标,以判断受试物对雄性小鼠性交能力的影响。
2.2.2 实验方法
2.2.2.1 实验动物
健康成年雄性小鼠,每组10只; 健康成年雌性小鼠,每组30只。
2.2.2.2 剂量分组
设1个阴性 (蒸馏水) 对照组和3个受试物剂量组,必要时可增设溶剂对照组和阳性对照组。3个受试物剂量中,其中1个应是人每公斤体重日推荐摄入量的10倍,另2个剂量根据受试物的具体情况上、下浮动。
2.2.2.3 实验步骤
于实验开始第一天,给予慢性悬吊应激刺激。将小鼠头朝下悬吊,下面为18℃的水,使小鼠处于强迫抬头,呈挣扎的紧张状态。第一天吊30min,以后逐日增加10～20min,直至1h。每次解除应激状态后10min,给予受试物,连续21d。于最后1次给受试物30min后,将成年雌性小鼠与雄性小鼠合笼 (雌:雄=3:1),置于暗室内观察,记录合笼至第一次交配的时间 (交配潜伏期),20min内交配次数。
2.2.3 数据处理及结果判定
试验数据采用方差分析方法。受试物组与对照组比较,至少一项指标呈阳性并经统计学处理有显著性差异 (P<0.05),即可判定该受试物交配试验阳性。
3 勃起试验
3.1 原理
应用去势成年雄性大鼠进行实验,以电刺激诱使阴茎勃起,观测受试物对阴茎勃起的潜伏期等指标的影响,以判断受试物对性功能的影响。
3.2 仪器和试剂
电刺激仪,丙酸睾丸素注射液 (50g/L),0.6%戊巴比妥钠,青霉素。
3.3 实验方法
3.3.1 实验动物
断乳1个月左右的Wistar或SD种雄性大鼠,每组10只,去势。
3.3.2 剂量分组
设1个阴性对照组和3个受试物剂量组,必要时可设1个正常动物对照组及1个阳性对照组 (丙酸睾丸素)。3个受试物剂量中其中一个应是人每公斤体重日推荐摄入量的5倍,另2个剂量根据受试物的具体情况上、下浮动。
3.3.3 实验步骤
动物在0.6%戊巴比妥钠 (45mg/kg) 麻醉下,消毒阴囊皮肤,摘除双侧睾丸。术后肌注青霉素20000U/kg,连续3d,然后分组,经口给予受试物 (但阳性对照组为皮下注射丙酸睾丸素,2mg/kg),每天1次,连续20d。给受试物后第21d,将电刺激仪的刺激电极放置于大鼠阴茎部位,给予局部电刺激,电流强度为4mA,记录从刺激开始至阴茎勃起时间 (勃起潜伏期)。
3.4 数据处理及结果判定
结果进行方差分析。受试物组与对照组比较,经统计差异有显著性 (P<0.05),可判定该受试物勃起试验阳性。
十三、人体试食试验规程
1 主题内容与适用范围
本规程规定了为验证保健食品各种保健作用而进行人体试验所必须遵守的基本原则。
本规程适用于判定保健食品的各种保健作用。
2 评价的基本原则
2.1 对保健食品的要求
供试的食品,必须有其来源、组成、加工工艺和卫生条件的详细说明。
供试的食品,必须已经过食品安全性毒理学评价证明是安全的。
供试的食品,必须已经过动物或体外试验,确定其具有需验证的某种特殊功效。
2.2 试验前的准备
拟定计划方案及进度,并经承办单位邀请有关专家进行论证。
根据受试物的性质、试验期限和人群要求,选择一定数量的受试者,一般每组30人。
开始食用前要根据受试物性质,估计食后可能产生的反应,并提出相应的处理措施。
2.3 对受试者的要求
选择受试者必须严格遵照自愿的原则,根据所需判定功效的要求进行选择。
确定受试对象后要进行单独谈话,使受试者充分了解试食试验的目的、内容、安排及有关事项,解答受试者提出的与试验有关的问题,消除可能产生的疑虑。
受试者必须有可靠的病史,以排除可能干扰试验目的的各种因素。
志愿受试者应填写参加试验的志愿书,并接受志愿书上确定的陈述,“我已获得有关食用试验的食物的性质和有关资料,并了解了试验目的、要求和安排,自愿参加试验,遵守试验的要求和纪律,积极主动配合,如实反映对试验的反应,逐日记录活动和生理的重要事件,接受规定的检查”。志愿受试者和医学监护人在志愿书上签字。志愿者填写志愿书后应经课题负责单位批准。
2.4 对实施试验者的要求
进行人体试食试验的单位应是卫生部认定的保健食品功能学检验机构。
主持试验的有关人员都必须参加试验。
以人道主义态度对待志愿受试者,以保障受试者的健康为前提。
与医学监护人取得密切联系,指导受试者的日常活动,监督检查受试者遵守试验有关规定。
在志愿者身上采集各种生物样品应详细记录采集样品的种类、数量、次数、采集方法和采集日期。
2.5 试验观察指标的确定
2.5.1 在被确定为志愿受试者之前,应进行系统的常规体检。
2.5.2 根据受试物的性质和作用,确定观察的指标,在受试期间应取得下列资料:
2.5.2.1 主观感觉 (体力和精神的);
2.5.2.2 进食状况;
2.5.2.3 生理指标 (血压、心率等),客观的症状和体征;
2.5.2.4 常规的血液学指标 (血红蛋白、红细胞和白细胞计数,必要时做白细胞分类),生化指标 (转氨酶、血清蛋白质、白蛋白/球蛋白比值、尿素氮、血脂、血糖等);
2.5.2.5 针对性指标,即与保健作用有关的指标,如增强免疫功能、抗疲劳、延缓衰老等方面的指标。
3 给受试者以适当的物质奖励或经济补助。
4 退出试验。
由于受试者生理或病理的原因,确定不能继续试验时,以医学监护负责人签署意见,课题负责人批准,可准予退出试验。由于其他个人原因而要退出试验者,应劝说其坚持参加试验,未经批准而擅自退出试验者,受试者应向试验承办单位赔偿损失。